CAR-T細胞免疫療法的研究進展

榮斌 原野 吳純啟 李曉旭 王全軍

嵌合抗原受體（CAR，Chimeric antigen receptor）-T細胞免疫療法是一種腫瘤過繼細胞免疫療法，基本原理是利用基因工程修飾T淋巴細胞，使其表達嵌合抗原受體，以非MHC（major histocompatibility complex，主要組織相容性復合體）限制性的方式殺傷腫瘤細胞。CAR的優(yōu)點在于能非 MHC依賴性識別腫瘤蛋白質和脂類抗原，不需要經過抗原遞呈細胞（antigen-presenting cell，APC），目前已經發(fā)展到第四代，早期主要用于治療 B細胞急性淋巴細胞白血?。˙-ALL），慢性淋巴細胞性白血病和 B細胞非霍奇金淋巴瘤，近年來也用于治療實體瘤、HIV等。雖然CAR-T細胞在臨床試驗中取得了顯著的效果，但同時也出現了諸多安全性問題，包括細胞因子釋放綜合征、腫瘤溶解綜合征、神經毒性和脫靶效應等。

1 CAR-T細胞免疫療法及原理

1.1 CAR-T設計原理

正常 T細胞的活化有賴于雙信號：第一信號由TCR識別APC表面的抗原肽-MHC復合物（p-MHC）啟動；第二信號由T細胞和APC間共刺激分子的相互作用啟動（即B7/CD28協同刺激信號）。而CAR-T細胞技術的設計原理是使 T細胞不需要依賴MHC分子和APC，將識別腫瘤相關抗原（TAA）的單鏈抗體（scFv）、跨膜的共刺激結構域（如CD28和 CD4-1BB）和 T細胞的活化基序結合為一體，通過基因轉導的方法轉染T淋巴細胞，經基因修飾的T細胞通過表達單鏈抗體增強結合腫瘤細胞的能力，同時激活T細胞，使其增殖并激活其細胞毒活性，使其能特異性地識別和殺傷腫瘤細胞。

1.2 CAR結構

CAR基本結構（即第一代CAR結構）包括胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域。胞外結構域是由單克隆抗體的重鏈和輕鏈的抗原結合區(qū)組成的單鏈可變片段（scFv），能夠識別特定的腫瘤抗原；跨膜結構域有 CD4、CD7、CD8、CD28 和CD3ζ等蛋白分子；胞內結構域為T細胞受體 TCR/CD3ζ鏈或免疫球蛋白 Fc受體 FcεRIγ鏈，含有免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs），可發(fā)揮信號轉導功能。

隨后的CAR大多遵循相同的結構模式，第1代CAR在胞內只有1個T細胞CD3ζ受體的信號區(qū)；第2代CAR增加了1個共刺激分子信號〔如CD27、CD28、OX40、可誘導共刺激分子（inducible costimulatory molecule，ICOS）或 CD137（4-1BB）等〕，可實現協同刺激分子和細胞內信號的雙重活化，使T細胞持續(xù)增殖并釋放細胞因子，提高T細胞的抗腫瘤能力；第3代增加了2個共刺激分子信號，相比第2代，可使T細胞持續(xù)活化增殖，增強殺傷腫瘤細胞作用。目前，用于臨床治療研究的主要為第 2代和第 3代CAR-T細胞技術，其中用來攜帶CAR的載體主要來源于逆轉錄病毒和慢病毒。第 4代 CAR （或TRUCKs）在前3代的基礎上增加了一個或多個可以編碼CAR及其啟動子的載體，在T細胞激活時可以產生高水平的細胞因子（如IL-12），從而調節(jié)局部微環(huán)境并輔助CAR-T細胞功能。

1.3 CAR的表達

外源基因導入細胞中通常需要運輸工具，因此，將CAR基因整合到T細胞中（即轉染）使其成功表達于T細胞表面需要借助特殊的方法，包括病毒法和非病毒法。病毒類載體如復制缺陷的逆轉錄病毒（γ逆轉錄病毒或慢病毒）可以通過病毒整合酶的作用，將其逆轉錄到 T細胞DNA中，從而成為該細胞基因組的一部分。但是，由于良好操作規(guī)范下的逆轉錄病毒生產耗費時間且費用昂貴，因此有些研究小組采用非病毒轉導的方法來實現永久性轉導，如采用特定的基于轉座子的系統，包括“睡美人”（sleeping beauty，SB）轉座系統和piggyBac（PB）轉座子。但是，通過這些方法成功表達CAR的T細胞需要在體外擴增到足夠的數量才能輸入體內產生治療效果。

2 CAR-T細胞免疫療法的臨床應用

過繼性免疫效應細胞治療（ adoptive cell transfer therapy，ACT），是指從腫瘤患者中分離免疫活性細胞，在體外進行擴增和功能鑒定，然后向患者轉輸，從而直接殺傷腫瘤或激發(fā)機體的免疫應答殺傷腫瘤細胞。ACT包括非特異性免疫治療和特異性免疫治療，CAR-T細胞免疫療法屬于后者。接受CAR-T細胞免疫療法的患者，需要從其體內分離免疫 T細胞，利用基因工程將CAR表達于T細胞；然后進行體外培養(yǎng)，大量擴增 CAR-T細胞，一般一個病人需要幾十億，乃至上百億個CAR-T細胞；最后把擴增好的 CAR-T細胞輸回病人體內，嚴密監(jiān)護病人。

2.1 CAR-T細胞免疫療法在B細胞淋巴瘤中的應用

2.1.1 非霍奇金淋巴瘤CAR-T細胞免疫療法的早期臨床試驗主要集中在治療非霍奇金淋巴瘤（NHL）。貝勒醫(yī)學院（BCM）、希望之城和弗雷德哈欽森癌癥研究中心（FHCRC）等研究團隊和Memorial Sloan Kettering癌癥中心（MSKCC）的研究組以及Savoldo等人證明了用靶向CD19的含有CD28共刺激結構域的第2代CAR-T細胞免疫療法治療慢性淋巴細胞性白血病（CLL）或濾泡性淋巴瘤取得了較好的療效，且第2代CAR明顯促進了T細胞的擴增、增強了T細胞持久性。盡管總體療效較好，但偶爾出現的毒性反應如細胞因子釋放綜合征（CRS）說明CAR-T細胞免疫療法需要進一步評估。

近兩年的各項研究正逐步改善早期臨床試驗中治療NHL出現的各項問題。在FHCRC研究人員的最新一項臨床試驗中，34名復發(fā)/難治性NHL的患者接受19BBz CAR治療。絕大多數患者有彌漫性大 B細胞淋巴瘤（DLBCL，n=18），其余為濾泡型淋巴瘤（n=6），CLL（n=6）或套細胞淋巴瘤（n=4）。注入的CD19 CAR-T細胞具有確定的亞群，即比例為1∶1的CD8+T中央型記憶細胞與 CD4+T細胞。他們還比較了用環(huán)磷酰胺+氟達拉賓或環(huán)磷酰胺（沒有氟達拉賓）的預處理方案，結果顯示：用氟達拉濱和環(huán)磷酰胺治療的患者中，CAR-T細胞的持久性和擴增性增加，且與僅用環(huán)磷酰胺治療的患者相比，CR率得到改善。在由FHCRC治療的最佳預處理方案的隊列中，DLBCL的CR率為38%（3/8），濾泡性淋巴瘤的CR率為67%（2/3）。此外，CLL的CR率為50%（n=3/6），表明CLL早期試驗的結果得到改善，最有可能的原因是改善了調節(jié)化療。他們還證明了由于細胞介導的抗鼠scFv T細胞應答導致CAR T細胞持續(xù)性差的潛在原因。因此，在調節(jié)化療中加入氟達拉濱的益處是使對CAR的宿主T細胞免疫應答最小化。UPENN研究人員在由 Kite Pharma贊助的I/II 期臨床試驗中再次證實DLBCL對19-28zCAR-T細胞敏感。

自從首次報道針對非霍奇金淋巴瘤的CAR-T細胞免疫療法的8年以來，諸多研究小組經過不懈努力，他們的累積研究工作已經確定了一個更優(yōu)化的的調理化療方案、有效和安全的CAR-T細胞劑量范圍以及最佳的CAR設計方案。盡管取得了這些成功，但其他類型的NHL仍然有更多的工作要做，比如 CLL。由于不適宜的腫瘤微環(huán)境，這種疾病可能對免疫干預更具抵抗力，或者來自這些患者的 T細胞可能比其他B細胞惡性腫瘤持續(xù)受損更嚴重，需要進一步優(yōu)化預處理方案。

2.1.2 B細胞急性淋巴細胞白血病國內對CAR-T細胞免疫療法治療急性 B淋巴細胞白血病的研究取得了巨大進展。根據第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院血液科的臨床觀察，2015年4月—2016年1月期間，3例復發(fā)/難治性急性 B淋巴細胞白血病患者采用CAR-T細胞治療。3例患者均為多次誘導化療不能達到完全緩解，或復發(fā)后再次誘導治療無效。均采集自體外周血T淋巴細胞進行轉染、培養(yǎng)?；剌斍耙苑_拉濱+環(huán)磷酰胺方案預處理，回輸CAR-T細胞數量為0.97至1.0×106/kg。結果2例患者在CAR-T細胞輸注后1月內達到完全緩解，1例患者無效。達到緩解的2例患者在CAR-T細胞治療后的第 3和第 6個月復發(fā)。復發(fā)后的 1例患者出現CD19陰性克隆復發(fā)；在整個治療過程中，未發(fā)生嚴重的不良反應。因此得出結論：CAR-T細胞可以有效的治療復發(fā)/難治CD19抗原陽性急性淋巴細胞白血病，能夠降低耐藥患者體內腫瘤負荷，甚至達到完全緩解。

2.2 CAR-T細胞免疫療法在實體瘤中的應用

CAR-T細胞免疫療法在治療血液腫瘤方面取得了顯著的成功，尤其是CD19-CARs在治療急性和慢性B淋巴細胞白血病和患有淋巴瘤和惡性腫瘤的患者的臨床試驗中均顯示出良好的治療效果。目前越來越多的臨床試驗集中在實體瘤，靶向表面蛋白包括癌胚抗原（CEA）、糖基化血紅蛋白GD2、間皮素、白細胞介素13受體α（IL-13Rα）、人表皮生長因子受體2（HER2）和（FAP）和L1細胞粘附分子（L1CAM）等。

2.2.1 神經母細胞瘤神經母細胞瘤（neuroblastoma，NB）是兒童最常見的顱外實體瘤，主要起源于腎上腺，NB發(fā)病早、惡性程度高、預后差，傳統的手術切除、放療、化療以及造血干細胞移植等多重療法介入，NB患兒總體生存率已有所提高，但高危患兒臨床預后仍不佳，因此CAR-T細胞免疫療法有望成為較好的治療備選方案。

神經節(jié)苷脂GD2作為腫瘤相關糖類抗原，與腫瘤的增殖、擴散、血管生成、代謝、免疫相關。研究發(fā)現，GD2在神經母細胞瘤組織中呈高密度表達，而在其他神經源性腫瘤低密度表達，因此GD2-CAR-T細胞免疫療法已在臨床試驗中作為治療神經母細胞瘤的最佳方案。Chrystal U.Louis等合成了GD2-CAR-T細胞治療神經母細胞瘤患者，且在EBV特異性細胞毒性 T淋巴細胞（EBVCTL）和活化T細胞（ATC）中表達了兩種可以區(qū)分形式的 CAR，在之前的研究中他們已證實：表達GD2-CAR（CAR-CTL）的 EBVCTL在灌注早期比GD2-CAR ATC（CARATC）有更高水平的傳播。在他們最新的研究中，報道了19例高危神經母細胞瘤患者輸注 GD2-CAR-T細胞的長期臨床和免疫學結果：輸注緩解8例，活動性疾病11例。11例活動性疾病患者中有3例完全緩解。因此，GD2-CAR-T細胞免疫療法治療神經母細胞瘤效果良好。

2.2.2 惡性黑色素瘤惡性黑色素瘤（malignantmelanoma）是起源于胚胎期神經嵴的惡性腫瘤，其惡性度極高，預后差，以皮膚惡性黑色素瘤最常見。針對惡性黑色素瘤的手術治療，即使進行早期進行根治手術，患者5年生存率也低于70%，晚期患者5年生存率僅5%～10%。因此，越來越多的科學家將關注點放在CAR-T細胞免疫療法應用于治療惡性黑色素瘤上。

黑色素瘤攜帶大量突變基因，其表達的腫瘤新抗原可以被患者的適應性免疫系統識別，因此近年來新抗原被確定為潛在靶標。在 Efrat Merhavi-Shoham等科學家進行的ACT治療惡性黑色素瘤試驗結果中顯示：使用VEGFR2-CAR-T細胞的ACT的24名患者中，緩解率為4%。目前正在進行GD2-CAR-T細胞治療黑色素瘤的I期臨床試驗。

3 CAR-T細胞免疫療法的毒性

3.1 腫瘤靶向毒性

造成腫瘤靶向毒性的原因是攜帶CAR的T細胞快速、大量增殖，導致細胞內的炎性細胞因子短時間內迅速釋放，造成細胞因子釋放綜合征（cytokine-release syndrome，CRS），癥狀以寒顫、發(fā)熱為主。同時，由于CAR成功結合腫瘤細胞上的靶抗原，導致腫瘤細胞內容物大量釋放，從而造成以高鉀、高磷、高尿酸、低鈣癥狀為主的腫瘤溶解綜合征（tumor lysis syndrome，TLS）。第2代CD19-CAR-T細胞臨床試驗中，患者出現發(fā)熱、低血壓、譫妄現象等癥狀，可能與T細胞介導的炎癥、釋放大量炎性因子（如IL-6）有關。

3.2 非腫瘤/靶向毒性

CAR識別的抗原多為腫瘤相關抗原 （tumor associatedantigen，TAA），而腫瘤相關抗原并非腫瘤細胞所特有，其在健康組織上也存在不同程度的表達。這種CAR-T細胞在殺傷腫瘤細胞的同時也會攻擊正常組織造，這種毒性即非腫瘤靶向毒性，該毒性機制造成的毒性效應稱為脫靶效應。Beatty等科學家在治療惡性胸膜間皮瘤、轉移性胰腺癌的臨床試驗中表明，脫靶效應可造成患者心臟驟停、呼吸衰竭、等副反應，原因是間皮素可在正常腹膜、胸膜及心包間皮細胞上表達，CAR識別了正常組織、細胞上的間皮素并且對其產生殺傷作用，導致較為嚴重的后果。

3.3 非腫瘤/靶向外毒性

顧名思義，該毒性即CAR-T細胞對健康組織、非靶向抗原造成的毒性。該毒性機制最近出現在CART細胞療法的試驗模型中，其原理是CAR-T細胞發(fā)生效應后 T細胞的活性持續(xù)下降且存在于體內時間較長，從而間接影響體內局部微環(huán)境，導致細胞穩(wěn)態(tài)失調，引起毒性效應。Kalaitsidou等科學家報道了接受CD19靶向的第2代CAR-T細胞治療的小鼠出現了 Th1型的細胞因子驅動的急性毒性，同時報道了由于CD+4CAR-T細胞的慢性活性造成的骨髓細胞響應于Th2型細胞因子驅動的慢性毒性，這種慢性毒性導致髓樣細胞的特異性擴增。最終尸檢證明，受影響的動物呈現脾腫大，淋巴結充滿肉芽腫樣細胞；細胞因子分析顯示Th2細胞因子水平升高，特別是IL-10和IL-1，并且假定該細胞因子來源于在次級淋巴結結構內鑒定的大量CD+4CAR T細胞。然而受影響的動物基本上沒有CD+8CAR-T細胞和 B細胞，因此這項研究最終證明了CAR-T細胞長期在體內長期刺激時會存在自身毒性的潛能。

4 結語

CAR-T細胞免疫療法作為近期內最熱門的研究領域，FDA在2017年分別受理了諾華和凱特制藥CAR-T療法的生物制品申請，同時，全球第一個CAR-T療法上市；該療法早期主要集中于治療淋巴瘤和白血病，近年來在治療黑色素瘤、卵巢癌、神經膠質瘤等疾病的臨床試驗中也取得了巨大進展，在腫瘤的過繼細胞免疫治療方面有著有人的前景。

針對出現的一系列包括細胞因子釋放綜合征、脫靶效應在內的較嚴重的不良反應，國內外科學家也研究出諸多應對措施，如導入自殺基因、構建抑制性 CAR、構建雙靶抗原 CARs、改變 T細胞輸注途徑等。目前最常用的就是導入“安全開關”（自殺基因），導入自殺基因即在 CAR內導入一個共表達的自殺基因，當CAR-T細胞增殖且發(fā)揮效應過快時激活自殺基因，誘導CAR-T細胞凋亡，從而終止治療。常見的自殺基因有誘導型半胱天冬酶 9（iC9）基因、編碼單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）。Lihua E.Budde1、Carolina Berger等人的研究團隊激活已用iC9自殺開關證明導入自殺基因的CAR-T細胞在體外和體內均能有效除去轉導的T細胞，該工作證明了以安全和更有效的方式治療 CD20+惡性腫瘤的方法的可行性和前景，并且該研究團隊計劃進行這種方法治療復發(fā)性無痛性B-NHL的I期臨床試驗。

綜上，在短短幾十年內，CAR-T細胞免疫療法從20世紀 80年代晚期首次被人們提出作為一種抗癌策略，到近幾年變成了可實際操作的方案治療難治且致命的腫瘤，彰顯出這一領域的光明前景。在國內外科學家的努力和創(chuàng)新下，CAR-T細胞治療技術必將成為眾多惡性腫瘤患者的福音。〓

（摘自《中西醫(yī)結合心血管病雜志》2018年第30期）