干擾SIRT7抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力

陳曉曦，陳旭旭，林佳浩，陳吉彩，黃國裕

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 疝與腹壁外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院， 浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015）

Sirtuin（SIRT）家族（包括SIRT1-7）是一組NAD+依賴的去乙?；约癆DP-核糖基轉(zhuǎn)移酶家族，它們在能量代謝、基因組穩(wěn)定性、衰老以及壓力抵抗等方面起到重要作用[1]。SIRT7主要在細(xì)胞核表達(dá)，它能與組蛋白相互作用來調(diào)節(jié)核糖體基因轉(zhuǎn)錄[2]。 SIRT7被認(rèn)為在轉(zhuǎn)錄過程中對連接染色體重建復(fù)合體與RNA Pol I中起到重要作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)SIRT7在小鼠模型和murine細(xì)胞系中有抑制腫瘤生長的作用[4]。但也有研究表明SIRT7能通過去乙?；鸵种颇[瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄來促進(jìn)腫瘤的生長[5]。甲 狀腺癌中，目前有相矛盾的結(jié)果，DE NIGRIS等[6]發(fā)現(xiàn)SIRT7在甲狀腺癌細(xì)胞和組織中表達(dá)升高，不過ALJADA等[7]和CHEN等[8]卻發(fā)現(xiàn)SIRT7在甲狀腺癌中的mRNA表達(dá)水平低于癌旁非腫瘤性甲狀腺組織，并且，到目前為止，SIRT7在甲狀腺癌細(xì)胞中的作用未見報道。因此，本研究擬通過研究干擾SIRT7對甲狀腺癌細(xì)胞BCPAP體外增殖、遷移和侵襲能力的影響，以進(jìn)一步明確SIRT7與甲狀腺癌的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 載體和病毒：干擾SIRT7的慢病毒由上海漢恒生物科技有限公司生產(chǎn)。載體為pHBLV-CMVIEZsGreen-T2A-Puro。干擾慢病毒（shSIRT7組）和陰性對照病毒（陰性對照組）的最終病毒滴度均為2× 108PFU/mL。

1.1.2 細(xì)胞系：人甲狀腺癌細(xì)胞系BCPAP購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.3 主要試劑：10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素、高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime-ScriptTMRT Master Mix，日本TaKaRa公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度試劑盒（上海碧云天公司）；兔抗人SIRT7多克隆抗體（1:1 000，ABV11620-50，蘇州百奇生物科技有限公司）；山羊抗兔二抗（ab97200，英國Abcam公司）；兔抗人GAPDH（1:1 000，ab8245，英國Abcam公司）；辣根過氧化物酶HRP-ECL（美國Millipore公司）；CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司）；Transwell板（美國Corning公司）；侵襲膠（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中。CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ℃，5% CO2。干擾SIRT7的穩(wěn)定細(xì)胞株由慢病毒轉(zhuǎn)染并在2 μg/mL的嘌呤霉素中篩選2周。

1.2.2 RT-PCR：用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將500 ng總RNA合成cDNA。將cDNA稀釋3倍后用RT-PCR試劑盒在RTPCR儀（美國BioRad公司）上合成。選用GAPDH為內(nèi)參基因。各基因的引物為：SIRT7正向引物5’-AAAGGG AGAAGCGTTAGTGC-3’，反向引物5’-ACGCAGGAGGTACAG ACTTC-3’；GAPDH正向引物5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGC AGG-3’，反向引物5’-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min，然后94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行40個循環(huán)，最后72 ℃ 5 min后4 ℃維持。循環(huán)結(jié)束后，分析熔解曲線保證PCR產(chǎn)物的均一性。用2-ΔCt法對數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.3 Western blot：細(xì)胞用RIPA裂解液在冰上裂解30 min，然后離心收集上清并用BCA蛋白濃度試劑盒測定濃度后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。將膜置于10%脫脂牛奶中室溫封閉1 h后用一抗稀釋液稀釋的兔抗人SIRT7多克隆抗體在4 ℃冰箱孵育過夜。第2天用山羊抗兔二抗室溫孵育30 min。二抗孵育結(jié)束后，用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法進(jìn)行顯色，在凝膠成像儀上拍攝[9]。內(nèi)參抗體為兔抗人GAPDH。

1.2.4 細(xì)胞增殖活力檢測：參照CCK-8試劑盒操作說明進(jìn)行檢測。實驗前1 d將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以1 000個/孔的密度接種在96孔板。檢測時向96孔板每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，然后將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后用酶標(biāo)儀測定在450 nm 處測定吸光度。去掉每組5個復(fù)孔中的最大值和最小值，統(tǒng)計吸光度作為細(xì)胞增殖活力值。鋪板第2天檢測數(shù)值計為第1天。鋪板后隔1天換1次培養(yǎng)基。細(xì)胞增殖活力（%）=[A（加藥）-A（空白）]/ [A（未加藥）-A（空白）]×100%。A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度；A（未加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

1.2.5 劃痕實驗：干擾SIRT7的BCPAP細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞以5×105每孔的密度接種在6孔板中并培養(yǎng)過夜。當(dāng)細(xì)胞密度接近90%時，用移液器槍頭在孔底的細(xì)胞層上劃痕，然后用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3遍以移除脫落的細(xì)胞，剩余細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下拍照并測量細(xì)胞遷移距離。

1.2.6 細(xì)胞遷移和侵襲實驗：遷移實驗：將6×104個細(xì)胞混懸在0.2 mL無血清培養(yǎng)基中并鋪板在24孔Transwell板的上層小室中，下層小室加入0.6 mL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，然后用棉簽將小室上層的細(xì)胞擦除，將小室底部的細(xì)胞用甲醛固定后再用0.1%結(jié)晶紫染液染色，在顯微鏡下對小室底部的遷移細(xì)胞進(jìn)行觀察拍照。侵襲實驗與遷移實驗步驟相似，但需要在細(xì)胞鋪板前在上層小室中加入侵襲膠。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意 義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建干擾SIRT7的甲狀腺癌細(xì)胞BCPAP穩(wěn)定株 分別在mRNA和蛋白水平驗證SIRT7的干擾結(jié)果。shSIRT7組的mRNA水平較陰性對照組顯著下降（P＜0.01），shSIRT7組細(xì)胞的SIRT7蛋白表達(dá)量也較陰性對照組顯著降低（P＜0.01），見圖1。

2.2 干擾SIRT7對BCPAP細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲能力的影響 干擾SIRT7之后，BCPAP細(xì)胞的增殖能力顯著降低，劃痕愈合能力也下降，遷移和侵襲能力都受到了顯著抑制，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2-4。

圖1 干擾SIRT7后BCPAP細(xì)胞的SIRT7 mRNA和蛋白相對表達(dá)量

圖2 干擾SIRT7后BCPAP細(xì)胞的體外增殖活力變化

3 討論

研究顯示，多個SIRT家族成員在不同的腫瘤中扮演了不同的角色，這可能取決于具體的組織和腫瘤類型[10]。比如SIRT1在胃癌[11]、結(jié)腸癌[12]、前列腺癌[13]以及皮膚癌[14]等腫瘤中表達(dá)是升高的，這提示它在這些腫瘤中應(yīng)該扮演了促進(jìn)腫瘤形成的作用。但另外有一些研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在乳腺癌[15]中表達(dá)是降低的，并且，在小鼠APCmin/+模型中，SIRT1能抑制小鼠腸道腫瘤的形成[16]。與此相類似的還有SIRT2，它在乳腺癌[17]、膠質(zhì)瘤[18]、皮膚癌[19]等腫瘤中表達(dá)降低，而在急性髓性白血病[20]及前列腺癌[21]中表達(dá)升高。因此，我們不能隨便把一種腫瘤中的研究結(jié)論外推到另一種腫瘤中去。

圖3 干擾SIRT7后BCPAP細(xì)胞的劃痕愈合能力變化

圖4 干擾SIRT7后BCPAP細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化

目前發(fā)現(xiàn)SIRT7在大多數(shù)腫瘤中的表達(dá)是上調(diào)的。比如KIM等[22]發(fā)現(xiàn)SIRT7在人肝癌組織中表達(dá)上調(diào)并且敲減SIRT7能通過影響細(xì)胞周期和自噬相關(guān)蛋白來抑制肝癌細(xì)胞體外和體內(nèi)生長。YU等[23]發(fā)現(xiàn)SIRT7在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)并且SIRT7能通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路和EMT來影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移。ASHRAF等[24]發(fā)現(xiàn)SIRT7在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，GENG等[25]發(fā)現(xiàn)SIRT7表達(dá)上調(diào)與乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)。此外，SIRT7還被發(fā)現(xiàn)在胃癌[26]和卵巢癌[27]細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。MCGLYNN等[28]等卻發(fā)現(xiàn)SIRT7在胰腺癌中表達(dá)降低，并且SIRT7表達(dá)高的胰腺癌患者有更長的術(shù)后生存時間。這些結(jié)果提示SIRT7可能同時具有癌基因和抑癌基因的作用。目前SIRT7在甲狀腺癌中的研究有不一致的結(jié)論，DE NIGRIS等[6]發(fā)現(xiàn)SIRT7在甲狀腺癌細(xì)胞和甲狀腺癌組織中表達(dá)升高，但是ALJADA等[7]在包含乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、甲狀腺癌等多個腫瘤標(biāo)本的cDNA芯片上研究了SIRT7的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)SIRT7的mRNA表達(dá)水平在甲狀腺癌中是顯著下調(diào)的。我們之前的研究通過對包含43例甲狀腺癌和癌旁甲狀腺組織的組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)實驗，發(fā)現(xiàn)SIRT7在甲狀腺癌中的蛋白水平低于癌旁非腫瘤甲狀腺組織[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)干擾SIRT7能顯著抑制BCPCP細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。這些結(jié)果表明SIRT7可能在甲狀腺癌中扮演了癌基因的角色，因此，SIRT7可能是甲狀腺癌一個潛在的治療靶點。