扁豆花高效液相色譜指紋圖譜研究*

曹素梅，袁衛(wèi)斌，陳洪英

（仲景宛西制藥股份有限公司，河南 鄭州 450003）

扁豆花為豆科扁豆屬植物扁豆Dolichos lablabL.的干燥花，其性味甘、平，歸脾、胃、大腸經(jīng)，具有消暑、化濕、和中的功效，用于暑濕泄瀉、痢疾，主產(chǎn)于河南、安徽、浙江等地［1］。其主要含有原花青苷黃酮類、花青素、香豆精［2-3］、蘆?。?］、木犀草素、大波斯菊苷、木犀草素-4′-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、野漆樹苷和甘露醇［5］等。目前對(duì)扁豆花的質(zhì)量控制主要是采用定性鑒別和含量測(cè)定的方法［4-9］。中藥指紋圖譜研究技術(shù)更符合中藥的特點(diǎn)，在研究中藥有效成分、控制中藥質(zhì)量及鑒別方面已日趨完善，且得到了國(guó)際廣泛認(rèn)可［10-12］。為了系統(tǒng)、完整地反映扁豆花藥材的內(nèi)在質(zhì)量，參考了藥材指紋圖譜的建立方法［13-18］，建立了扁豆花的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2012.1版本，以下簡(jiǎn)稱評(píng)價(jià)軟件）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，為扁豆花藥材的質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器，在線脫氣機(jī)，四元梯度泵，柱溫箱，化學(xué)工作站，安捷倫公司）；MS-105型電子分析天平、AL104型電子天平（Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度為90.2% ，批號(hào)為 100080-201408）；水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，扁豆花藥材經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)代麗萍教授鑒定為豆科扁豆屬植物扁豆Dolichos lablabL.的干燥花，產(chǎn)地信息見表1。

表1 10批扁豆花產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Luna C18100A 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：358 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（見表2）。分別吸取溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，在擬訂色譜條件下，供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上有相應(yīng)的色譜峰，經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器純度測(cè)試，二者一致，各色譜峰均達(dá)到了基線分離。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

稱取蘆丁對(duì)照品，精密稱定，用甲醇溶解并制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。取藥材粉末（過40目篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取同一供試品粉末，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，考察色譜峰相似度的一致性，用指紋圖譜軟件計(jì)算。以7號(hào)峰為參照物，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于 0.5% （n＝6），相對(duì)峰面積 RSD均小于3.0% （n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密取同一供試品粉末，共6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，考察色譜峰相似度的一致性，用指紋圖譜軟件計(jì)算。以7號(hào)峰為參照物，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的 RSD均小于0.5%（n＝6），相對(duì)峰面積的 RSD均小于 4.0% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品粉末，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別于 0，2，4，6，8，10，12 h時(shí)進(jìn)樣，記錄色譜圖，考察色譜峰相似度的一致性，用指紋圖譜軟件計(jì)算。以7號(hào)峰為參照物，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的 RSD均小于0.4%（n＝6），相對(duì)峰面積的 RSD均小于3.0%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 樣品測(cè)定

分別取10批扁豆花藥材樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別測(cè)定，記錄色譜圖。

2.5 扁豆花指紋圖譜分析

共有峰確定：根據(jù)10批扁豆花樣品分析結(jié)果，確定了12個(gè)共有峰，其中7號(hào)峰為蘆丁。以蘆丁峰為參照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間見表3。色譜圖見圖1。

相似度計(jì)算及扁豆花對(duì)照?qǐng)D譜的生成：采用評(píng)價(jià)軟件中位數(shù)法分析，以10批扁豆花生成的共有模式為對(duì)照，計(jì)算各批樣品相似度，計(jì)算結(jié)果見表4。10批樣品HPLC指紋圖譜共有模式圖及生成的對(duì)照?qǐng)D譜見圖2和圖3。

表3 10批扁豆花指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間（min）

3 討論

提取方法選擇：為了最大程度提取扁豆花中的化學(xué)成分，試驗(yàn)中考察了甲醇、60%甲醇、95%乙醇的提取效果。結(jié)果表明，60%甲醇提取得到的信息最豐富。同時(shí)比較了超聲和回流提取，結(jié)果表明，兩者的提取效果差異不明顯，從操作簡(jiǎn)便角度出發(fā)，選擇了超聲提取。

檢測(cè)波長(zhǎng)選擇：本試驗(yàn)中采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)扁豆花HPLC指紋圖譜進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，考察了257，310，358 nm波長(zhǎng)處的圖譜特征。結(jié)果顯示，358 nm波長(zhǎng)條件下，各成分峰峰形較好，峰面積適中，因此設(shè)定358 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表4 10批扁豆花藥材相似度測(cè)定結(jié)果

圖1 高效液相色譜圖

圖2 10批扁豆花高效液相色譜指紋圖譜共有模式圖

圖3 扁豆花高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜

流動(dòng)相選擇：在色譜條件選擇過程中，共比較了乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液和乙腈-1%冰乙酸溶液4種流動(dòng)相體系，結(jié)果顯示，不同的流動(dòng)相體系對(duì)峰的分離效果差異較大。甲醇-0.1%磷酸溶液分離效果較差，乙腈-0.1%磷酸溶液分離效果較好，基線平穩(wěn)，故被選為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

柱溫選擇：為了保持色譜分析的一致性，設(shè)定柱溫考察不同試驗(yàn)環(huán)境下的色譜分析，分別考察了25，30，35℃ 3種柱溫。結(jié)果顯示，在30℃下，分離效果較好，故選擇30℃作為柱溫。

綜上所述，通過對(duì)10批扁豆花藥材的指紋圖譜分析，可見各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間基本一致，色譜峰的整體面貌基本一致，但峰面積有差異，說明了其成分含量的差異性。從相似度評(píng)價(jià)結(jié)果來看，相似度均大于0.9，說明地域差異不明顯。本研究中建立了扁豆花藥材的HPLC指紋圖譜分析方法，為扁豆花藥材質(zhì)量的客觀評(píng)價(jià)提供了參考。