宮頸癌患者血漿miRNA- 214的表達(dá)水平及其對宮頸癌細(xì)胞的影響

施友文,楊浩然,衛(wèi)兵,張麗麗

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 婦產(chǎn)科,安徽 合肥 230031;2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué),安徽 合肥 230031；3.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦科,安徽 合肥 230031)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，僅次于乳腺癌和結(jié)直腸癌[1]。據(jù)國外文獻(xiàn)[2]報道，宮頸癌死亡人數(shù)位居女性癌癥死亡總數(shù)的第4位。盡管宮頸癌早期檢測手段多樣，如宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢測、陰道鏡活檢病理檢查等[3]，但其術(shù)后復(fù)發(fā)率偏高，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[4]。所以，宮頸癌的早期預(yù)防及診斷水平迫切需要進(jìn)一步提高。

微小核糖核酸(miRNA)是近年來關(guān)于宮頸癌的研究熱點(diǎn)之一。miRNA是一種內(nèi)源性、非編碼的單鏈小分子RNA，由19～23個核苷酸組成。成熟的miRNA具有調(diào)控靶基因表達(dá)的作用，能夠抑制靶mRNA的翻譯，最后在轉(zhuǎn)錄后基因水平調(diào)控靶基因的表達(dá)[5- 6]。近年來研究[7]發(fā)現(xiàn)，與宮頸癌相關(guān)的miRNA標(biāo)記物有多種，包括miRNA- 21、miRNA- 214、miRNA- 155等。MiRNA- 214是較早發(fā)現(xiàn)的具有抑制癌基因活性的miRNA[8- 10]，在宮頸癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中miRNA- 214表達(dá)水平下降，并且miRNA- 214的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、疾病的診斷、預(yù)后等密切相關(guān)。因此，本研究擬采用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測miRNA- 214 在宮頸癌患者血漿中的表達(dá)情況，以宮頸癌細(xì)胞株SiHa為細(xì)胞模型，觀察miRNA- 214對宮頸癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡的影響，了解其可能的分子機(jī)制，為宮頸癌的診斷和治療提供新的策略。

1 對象和方法

1.1 研究對象

以2016年1月至2018年1月在中國科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院確診的50例新發(fā)宮頸癌患者為宮頸癌組，平均年齡為(56.2±14.3)歲，均經(jīng)過組織病理學(xué)確診；同時選取相同年齡段體檢健康者50例(健康對照組)，按照年齡段與觀察組進(jìn)行匹配。本研究排除接受過手術(shù)治療、放療、化療等的宮頸癌患者，有嚴(yán)重臟器疾病(如心、肝、肺、腦、腎等器官及血液系統(tǒng)疾病)或其他系統(tǒng)腫瘤病史的患者。本研究符合中國科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會要求，并且患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 采集兩組全血標(biāo)本各5 ml，用EDTA抗凝管收集，然后離心，分離血漿，收集于EP管中，置冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR法檢測miRNA- 214的表達(dá) 20 μl PCR反應(yīng)體系為：1 μl特異性miRNA- 214 TaqMan檢測探針、2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl基因表達(dá)MasterMix、7 μl除RNA酶水以及反轉(zhuǎn)錄得到的總RNA 5 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s，進(jìn)行40個循環(huán)。對照組用0.1% DEPC處理。miRNA- 214的上游引物：5′- TGCGGACAGCAGGCACAGAC- 3′，下游引物：5′- GCAGTGCAGGGTCCGAGGT- 3′。最后用AB 17500高通量實(shí)時熒光定量PCR儀器進(jìn)行PCR檢測，用相對表達(dá)值表示miRNA- 214的表達(dá)水平。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 宮頸癌細(xì)胞SiHa由安徽醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室饋贈。SiHa在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2飽和濕度。取對數(shù)生長期細(xì)胞，隨機(jī)為宮頸癌對照組[轉(zhuǎn)染miRNA- 陰性(即miRNA- NC)]和宮頸癌轉(zhuǎn)染miRNA- 214組(轉(zhuǎn)染miRNA- 214模擬物)。轉(zhuǎn)染操作按說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染4 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，重新轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。最后，使用CCK- 8試劑盒(購于北京天根生物科技有限公司)，并根據(jù)說明書檢測兩組Siha細(xì)胞增殖的情況。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測miRNA- 214對SiHa細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響 胰酶消化液消化吸收細(xì)胞，70%乙醇固定，4 ℃過夜，棄去上清液，以50 μg·ml-1RNAse A溶液重懸，溶液放置1 h，溴化丙啶染液4 ℃下避光孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。最后進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測，操作嚴(yán)格按照細(xì)胞凋亡檢測盒說明書進(jìn)行，檢測盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。以上所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌組和健康對照組血漿中的miRNA- 214表達(dá)水平

PCR檢測檢測結(jié)果顯示，miRNA- 214血漿中的相對表達(dá)量宮頸癌組為(0.59±0.09) IU·ml-1,低于健康對照組的(1.08±0.18)IU·ml-1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 miRNA- 214對宮頸癌細(xì)胞SiHa增殖的影響

CCK- 8法檢測結(jié)果顯示，與宮頸癌對照組宮頸癌細(xì)胞SiHa相比，轉(zhuǎn)染miRNA- 214后的宮頸癌細(xì)胞SiHa的生長速度明顯減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明miRNA- 214對宮頸癌細(xì)胞SiHa生長有抑制作用。見圖1。

圖1宮頸癌細(xì)胞SiHa轉(zhuǎn)染miRNA-214組及宮頸癌對照組細(xì)胞生長速度水平

2.3 miRNA- 214對宮頸癌細(xì)胞SiHa周期和細(xì)胞凋亡的影響

與對照組相比，宮頸癌細(xì)胞SiHa轉(zhuǎn)染miRNA- 214組的細(xì)胞在S期細(xì)胞比例明顯降低，凋亡細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)，而在G2/M期的細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。結(jié)果表明宮頸癌細(xì)胞miRNA- 214表達(dá)水平的下降可能會加速宮頸癌細(xì)胞進(jìn)入G2或M期，反之，miRNA- 214過表達(dá)則能夠顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡。見表1。

表1兩組宮頸癌細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的比較

組 別不同細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)G1SG2/M凋亡率/%SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-214組67.70±3.1424.22±1.076.54±2.375.14±0.37宮頸癌對照組65.49±2.9927.97±1.429.88±1.734.01±0.42t值12.1410.795.573.92P值0.2310.1860.0270.013

3 討 論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，分子標(biāo)記物在其早期診斷中的作用一直是臨床研究熱點(diǎn)[11]。近年來大量學(xué)者致力于宮頸癌分子標(biāo)記物的研究，伴隨著研究的不斷深入，越來越多宮頸癌相關(guān)的分子標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)[12- 13]。馮倩倩等[14]發(fā)現(xiàn)，miRNA特別是miRNA- 214在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，因此，本研究分析了宮頸癌患者血漿中miRNA- 214表達(dá)水平及miRNA- 214對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡過程的影響，旨在進(jìn)一步闡明miRNA- 214在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組比較，宮頸癌患者血漿中miRNA- 214表達(dá)水平明顯下降，這與Wen等[15]的研究結(jié)論一致。Wen等認(rèn)為，在正常情況下機(jī)體內(nèi)各種miRNA表達(dá)量相對穩(wěn)定；當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)腫瘤病變后，腫瘤細(xì)胞大量地復(fù)制，可能會影響其它miRNA 的表達(dá)，從而出現(xiàn)某類型miRNA表達(dá)量下降；從另一個角度來說，如果刺激相應(yīng)類型miRNA的過表達(dá)，可能會在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染miRNA- 陰性宮頸癌細(xì)胞SiHa相比，轉(zhuǎn)染miRNA- 214的宮頸癌細(xì)胞SiHa生長速度明顯減慢，且S期細(xì)胞比例明顯降低，凋亡細(xì)胞比例明顯升高，在G2/M期的細(xì)胞也明顯減少。說明miRNA- 214可以抑制宮頸癌細(xì)胞SiHa進(jìn)入S期，并且促進(jìn)其凋亡。Zhang等[16]通過研究miRNA 對卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡過程影響的分子機(jī)制后認(rèn)為，miRNA對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過競爭核苷酸合成過程中所必需的酶來實(shí)現(xiàn)的，因此miRNA的過表達(dá)對腫瘤的生長具有一定的抑制作用。而國外幾項(xiàng)關(guān)于miRNA對腎癌、膀胱癌及胰腺癌的研究發(fā)現(xiàn)；miRNA不僅能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，還能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[17- 19]。研究者們發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)miRNA的過表達(dá)，可使得大量腫瘤細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期G2或M期，腫瘤細(xì)胞無法完成正常的細(xì)胞分裂，并最終走向凋亡。

綜上所述，宮頸癌患者血漿中miRNA- 214表達(dá)水平下調(diào)，可作為宮頸癌早期診斷分子標(biāo)志物。miRNA- 214可以抑制SiHa增殖，并促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞SiHa凋亡，miRNA- 214可能在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著抑癌作用。