慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜中Hp陽性對表皮生長因子表達(dá)的影響

楊靜，馮慶濤，楊鑄鋒，龍潤，楊金國，郭虹憶

(河北省中醫(yī)院 1.消化內(nèi)鏡科；2.功能科；3.脾胃病二科 河北 石家莊 050011)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)是臨床上常見的一種嚴(yán)重危及消化系統(tǒng)和人類健康的疾病[1- 2]。近年來，CAG的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢，并且癌變率較高，世界衛(wèi)生組織WHO已將其列為胃癌的癌前疾病[3]。CAG是胃黏膜損傷與修復(fù)的一種慢性過程，是胃黏膜遭到外界或毒性因素破壞，胃部黏膜內(nèi)免疫防御系統(tǒng)失衡的胃黏膜慢性炎性疾病，其主要表現(xiàn)為胃黏膜的慢性炎癥、胃黏膜變薄及固有腺體的萎縮、黏膜層內(nèi)的慢性炎癥細(xì)胞浸潤，胃黏膜固有腺體的數(shù)量減少或消失，并伴有大量的纖維組織增生和黏膜層增厚，以及不同類型的胃黏膜上皮腸化生和異型增生等情況[4- 6]。大量臨床和基礎(chǔ)研究證實，幽門螺桿菌(Hp)是CAG的主要致病因素[7]。由于人群中感染Hp耐藥菌株的比例逐漸上升、常規(guī)臨床的三聯(lián)療法對Hp的根除率逐漸降低及抗生素的不良反應(yīng)等問題，使得臨床治療和根治CAG變得十分困難。本研究通過采用化學(xué)藥物損傷的方法建立CAG大鼠模型，并給予Hp菌懸液灌胃，旨在觀察慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜中Hp陽性對表皮生長因子(EGF)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑與儀器

60只成年雄性SD大鼠，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。大鼠飼養(yǎng)在SPF級動物實驗室，室溫為(22±2) ℃，12 h/12 h循環(huán)晝夜光照。悉尼標(biāo)準(zhǔn)Hp菌株購于北京細(xì)胞生命科學(xué)研究所。一抗兔抗單克隆抗體EGF和β- 肌動蛋白(ACTB)、吲哚美辛、水楊酸鈉、乙醇均購于美國Santa Cruz生物技術(shù)有限公司；二抗山羊抗兔IgG購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SDS- PAGE電泳設(shè)備及轉(zhuǎn)膜儀購于美國Bio- rad公司。

1.2 胃炎模型制備[8]和各組給藥

將Hp菌株進(jìn)行復(fù)蘇，并接種在Hp布式瓊脂平板上，密封后置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。收集生理鹽水制備的Hp菌懸液并調(diào)整菌懸液菌量為1×1012CFU·ml-1。造模成功判斷標(biāo)準(zhǔn)為光鏡下顯示胃黏膜固有腺體減少[9]。

對照組：采用生理鹽水2 ml行大鼠灌胃，1次·d-1，共14周。

模型組：大鼠灌胃前禁食12 h，然后給予配制好的抗生素(滅滴靈、四環(huán)素和麗珠得樂混合液2 ml·只-1·d-1)連續(xù)3 d灌胃以清除胃內(nèi)雜菌，第4天起采用吲哚美辛溶液(2 ml·只-1·d-1)進(jìn)行連續(xù)2 d灌胃，破壞胃黏膜屏障，再給予大鼠水楊酸鈉和乙醇混合溶液(2 ml·只-1·d-1)灌胃，連續(xù)8周，制作慢性萎縮性胃炎模型。

實驗組：大鼠在模型組基礎(chǔ)上，給予大鼠Hp菌懸液2 ml灌胃，1次·d-1，連續(xù)6 d。

1.3 HE染色和Hp陽性觀察

大鼠腹腔注射麻醉后取胃黏膜標(biāo)本。沿胃大彎剪開，一半胃黏膜進(jìn)行Hp檢測；另一半胃黏膜進(jìn)行常規(guī)脫水透明，并用石蠟包埋，連續(xù)切片6張，厚5 μm，蘇木素染色，二甲苯透明，行HE染色，觀察大鼠胃黏膜的變化。

1.4 免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠胃黏膜EGF的表達(dá)

取胃黏膜石蠟標(biāo)本，用5%血清室溫封閉40 min，加入(1∶1 000)EGF單克隆抗體，4 ℃過夜孵育。隔天加入二抗(1∶1 000)，于37 ℃孵育30 min，加入SP后恒溫反應(yīng)持續(xù)30 min，加入DAB顯色液顯色，中性樹膠封片。EGF陽性表達(dá)主要表現(xiàn)為大鼠胃黏膜細(xì)胞內(nèi)檢測到棕黃色的顆粒。切片隨機(jī)選擇6個高倍鏡視野(×400)進(jìn)行計數(shù)，計算大鼠胃黏膜組織中EGF蛋白表達(dá)的平均光密度。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠胃黏膜EGF蛋白表達(dá)

取胃部標(biāo)本放試管中冰上裂解2 h，待裂解完全后放入離心機(jī)，以1 500 r·min-1離心15 min，調(diào)整各組蛋白濃度總量調(diào)整為30 g·L-1，加至10% SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜后加入單克隆抗體EGF和二抗。ECL顯色劑顯色，Bio- Pro凝膠成像分析儀成像，Quantity- one軟件對各泳道條帶進(jìn)行灰度掃描分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠胃黏膜HE染色結(jié)果

見圖1。

圖1大鼠胃黏膜HE染色×400

對照組胃黏膜上皮完整，可以觀察到正常的黏液細(xì)胞；模型組大鼠胃黏膜固有層腺體厚度正?；蜃儽?，僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤；實驗組胃黏膜腺體明顯減少或消失，胃黏膜細(xì)胞萎縮破裂，出現(xiàn)大量空泡，淋巴細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞浸潤，并伴有大量的纖維組織增生和黏膜增厚。

2.2 大鼠胃黏膜Hp陽性率

模型組Hp陽性率為65.00%，實驗組Hp陽性率為95.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.625，P=0.018)。

2.3 大鼠胃黏膜EGF免疫組化結(jié)果

見圖2。

大鼠胃黏膜EGF陽性蛋白表達(dá)的平均光密度對照組為0.64±0.11，模型組為1.34±0.23，實驗組為1.58±0.19。與對照組和模型組相比，實驗組EGF陽性蛋白表達(dá)的平均光密度明顯升高(F=5.937，P<0.05)。

2.4 大鼠胃黏膜EGF蛋白表達(dá)

見圖3。

圖2大鼠胃黏膜EGF免疫組化×400

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

圖3EGF蛋白表達(dá)

與對照組比較，模型組和實驗組EGF蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，實驗組EGF蛋白表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

目前研究己經(jīng)確認(rèn)，在60%～90%慢性胃炎患者的胃黏膜中可培養(yǎng)出Hp，Hp作為慢性萎縮性胃炎的主要致病因素，可引起慢性胃炎，并導(dǎo)致胃潰瘍和CAG，嚴(yán)重者則發(fā)展為胃癌[10- 11]。Hp致病是多因素共同作用的結(jié)果[12]，其致病性主要表現(xiàn)在：(1)Hp可以促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生多種酶類及相關(guān)代謝產(chǎn)物，對胃黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)行分解和破壞，導(dǎo)致胃黏膜組織損傷；(2)Hp菌體細(xì)胞壁具有l(wèi)ewisx、lewisy抗原和抗體包裹，容易引發(fā)自身免疫反應(yīng)；(3)Hp可以誘導(dǎo)胃黏膜產(chǎn)生炎癥因子，使大量巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞活化和浸潤；(4)Hp可以產(chǎn)生空泡毒素，引發(fā)細(xì)胞空泡變性的分泌型毒素蛋白表達(dá)；(5)Hp可誘發(fā)胃上皮細(xì)胞的凋亡和死亡，破壞胃黏液層的生理結(jié)構(gòu)和黏膜屏障。

本研究首先采用非甾體抗炎藥吲哚美辛予大鼠灌胃，破壞胃黏膜的修復(fù)和防御功能；并給予大鼠抗生素灌胃，殺滅和消除大鼠胃內(nèi)正常革蘭陽性菌、厭氧菌和常駐菌群等，破壞胃黏膜表面的黏液-碳酸氫鹽屏障，降低胃內(nèi)正常菌群的免疫防護(hù)作用；然后給予水楊酸鈉及乙醇混合溶液予大鼠灌胃，構(gòu)建慢性萎縮性胃炎大鼠模型；最后采用含有細(xì)胞毒素基因和空泡毒素基因的Hp灌胃，構(gòu)建Hp感染慢性萎縮性胃炎大鼠模型。

本研究結(jié)果顯示，對照組大鼠胃黏膜上皮完整，可以觀察到正常的黏液細(xì)胞；模型組大鼠胃黏膜固有層腺體厚度正?；蜃儽?，僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤；實驗組胃黏膜腺體明顯減少或消失，胃黏膜細(xì)胞萎縮破裂，出現(xiàn)大量空泡，淋巴細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞浸潤，并伴有大量的纖維組織增生和黏膜增厚。說明在化學(xué)藥物的基礎(chǔ)上給予大鼠Hp懸液灌胃會顯著增加其胃黏膜的刺激和損傷。

細(xì)胞內(nèi)EGF在胃黏膜的損傷和修復(fù)過程中有十分重要的作用。EGF能夠提高機(jī)體對葡萄糖和氨基酸的吸收，刺激體內(nèi)蛋白質(zhì)DNA和RNA的合成，具有促進(jìn)上皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞及黏膜組織等多種細(xì)胞有絲分裂的作用。EGF作為胃黏膜的的保護(hù)因子，調(diào)節(jié)參與胃黏膜的生長和成熟促進(jìn)胃黏膜的再生與修復(fù)，可與靶細(xì)胞膜上EGF特異性受體結(jié)合，并參與胃上皮細(xì)胞的增殖和遷移，參與促進(jìn)胃潰瘍的愈合[13- 14]。EGF在維持胃腸黏膜完整性，促進(jìn)胃上皮細(xì)胞的增殖分化，保護(hù)胃黏膜免受炎癥因子的破壞等方面起到重要作用[15- 16]。在胃腸道黏膜內(nèi)，EGF可以通過促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞的黏蛋白及前列腺素PGE2合成、刺激黏液和nco- 5的分泌，發(fā)揮擴(kuò)張血管、促進(jìn)黏膜內(nèi)的血流循環(huán)及抑制胃酸和胃蛋白酶的分泌的作用。同時，EGF還可通過促進(jìn)絨毛增生、隱窩細(xì)胞的增殖，促進(jìn)胃腸道黏膜的成熟、修復(fù)和再生。本研究結(jié)果表明，實驗組EGF陽性蛋白表達(dá)的平均光密度和蛋白的表達(dá)水平比模型組明顯升高，說明在Hp感染的慢性萎縮性胃炎大鼠中EGF參與胃黏膜組織的損傷過程。

綜上所述，EGF參與慢性萎縮性胃炎的胃黏膜損傷的修復(fù)過程，Hp陽性可明顯加重胃黏膜的損傷程度，與慢性萎縮性胃炎的胃黏膜損傷具有更明顯的相關(guān)性。因此，臨床上可針對EGF靶向治療Hp引起的胃部胃黏膜損傷。