阿托伐他汀鈣致糖代謝異常大鼠模型的建立

林燕珊，朱孔博，錢玲林，安麗，慕廣建，任利群,

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院1.老年醫(yī)學(xué)科；2.心血管內(nèi)科,江蘇 南京 210009)

他汀類藥物即3- 羥基- 3- 甲基- 戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，能夠有效降低膽固醇，降低心腦血管疾病死亡率，并已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的一級預(yù)防和二級預(yù)防[1- 2]。然而研究[3]發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀鈣治療后新發(fā)糖尿病風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，之后大量研究進(jìn)一步證實(shí)了他汀類藥物致新發(fā)糖尿病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加[4- 5]，并且呈劑量依賴性[6]。3項(xiàng)關(guān)于阿托伐他汀鈣的大規(guī)模隨機(jī)試驗(yàn)即TNI、IDEAL、SPARCL的研究結(jié)果提示，強(qiáng)化他汀治療增加新診斷糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[7]。盡管應(yīng)用他汀類藥物的獲益遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其致血糖異常風(fēng)險(xiǎn)，但為了使其臨床應(yīng)用獲益最大化，控制心血管事件殘余風(fēng)險(xiǎn)，深入研究他汀類藥物誘發(fā)糖尿病的分子機(jī)制十分重要。目前他汀類藥物引起糖代謝異常的研究多局限于體外細(xì)胞學(xué)研究[8- 10]，仍缺乏在體研究的動(dòng)物模型。本研究建立他汀誘發(fā)糖代謝異常的大鼠模型，為進(jìn)一步研究他汀類藥物致糖代謝異常的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

普通大鼠飼料(含碳水化合物45%、蛋白質(zhì)40%、脂肪10%、其他5%)購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司；阿托伐他汀鈣粉劑由諾華山德士(中國)制藥有限公司提供(批號(hào)：J20130172)；血糖儀、血糖試紙購自德國拜耳公司；大鼠胰島素定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于安徽巧伊生物科技有限公司，酶標(biāo)儀為美國Bio- Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性8周齡SPF級Wistar大鼠16只，體重(280±5) g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)(NO.201717658)。所有Wistar大鼠SPF環(huán)境飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在22～25 ℃，濕度為(55±5)%，光照黑暗循環(huán)(光照時(shí)間為7：00～19：00)。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后采用隨機(jī)數(shù)字表方法隨機(jī)分為兩組，即對照組及阿托伐他汀鈣組，每組8只。阿托伐他汀鈣組給予阿托伐他汀鈣50 mg·kg-1·d-1灌胃，對照組給予等量去離子水灌胃，兩組均干預(yù)24周。

1.3 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)及胰島素釋放試驗(yàn)

干預(yù)大鼠24周后行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)，禁食12 h 后剪尾采血測空腹血糖，并留取血清，隨后以2 g·kg-1葡萄糖灌胃，分別于30、60、90和120 min時(shí)間點(diǎn)采血測血糖，并留取血清。采用ELISA法測量血清胰島素，并計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評價(jià)(homeostasis model assessment，HOMA)指數(shù)，即胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(homeostasis model assessment for beta cell function，HOMA- β)=20×空腹胰島素水平/空腹血糖水平-3.5；胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA- IR)=空腹血糖水平×空腹 胰島素水平/22.5；胰島素敏感指數(shù)(homeostatic model assessment of insulin sensitivity，HOMA- IS)=1/HOMA- IR。

1.4 檢測血生化指標(biāo)及胰腺組織病理學(xué)觀察

干預(yù)大鼠24周后予10%水和氯醛腹腔注射麻醉,開胸經(jīng)左心室采血10 ml，離心取血漿檢測生化指標(biāo)。迅速分離胰腺，并在4%多聚甲醛溶液中保存固定24 h，經(jīng)石蠟包埋，層厚3 μm連續(xù)切片，行蘇木精- 伊紅染色，觀察對照組及阿托伐他汀鈣組大鼠胰腺組織的組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠體重及生化指標(biāo)比較

與對照組比較，阿托伐他汀鈣組大鼠體重、甘油三酯(TG)明顯降低(P<0.05)，谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酐(Cr)有升高趨勢，而總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL- C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL- C)均有降低趨勢，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

組 別體重/gALT/IU·mL-1AST/IU·mL-1Cr/μmol·L-1對照組478.0±11.673.1±6.5177.7±11.757.9±4.0阿托伐他汀鈣組423.4±25.178.1±19.0204.9±51.773.7±23.8P值<0.0010.5250.1690.131組 別TC/mmol·L-1TG/mmol·L-1HDL-C/mmol·L-1LDL-C/mmol·L-1對照組3.08±0.421.72±0.180.53±0.061.99±0.42阿托伐他汀鈣組2.77±0.341.37±0.240.47±0.111.76±0.19P值0.1430.0060.2100.194

2.2 兩組口服葡萄糖耐量試驗(yàn)比較

兩組間空腹血糖比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但30、60、90和120 min時(shí)阿托伐他汀鈣組的血糖明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

2.3 兩組胰島素釋放試驗(yàn)比較

與對照組比較，阿托伐他汀鈣組空腹、30、60、90和120 min的胰島素分泌水平均明顯降低(P<0.05)。見表3。

表2 兩組口服葡萄糖耐量試驗(yàn)比較mmol·L-1

表3 兩組胰島素釋放試驗(yàn)比較μIU·ml-1

2.4 兩組HOMA- β、HOMA- IR及HOMA- IS比較

與對照組相比，阿托伐他汀鈣組HOMA- β、HOMA- IR降低，而HOMA- IS升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

組 別HOMA-βHOMA-IRHOMA-IS對照組137.56±66.211.87±1.200.67±0.27阿托伐他汀鈣組63.96±40.870.89±0.321.27±0.52P值0.0180.0430.011

2.5 兩組胰腺組織病理學(xué)變化

與對照組比較，光鏡下阿托伐他汀鈣組胰腺組織形態(tài)學(xué)未見明顯變化,胰島細(xì)胞分布正常，核圓形，胞漿豐富，間質(zhì)無水腫，無變性壞死。見圖1。

3 討 論

他汀類藥物廣泛應(yīng)用于心血管和代謝性疾病的預(yù)防或治療，自JUPITER研究之后大量研究及薈萃分析證實(shí)了他汀類藥物致新發(fā)糖尿病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高，并且強(qiáng)化他汀治療比標(biāo)準(zhǔn)劑量更進(jìn)一步增加新診斷糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[3- 7]。深入研究他汀類藥物誘發(fā)糖代謝異常的分子機(jī)制須借助有效的動(dòng)物模型。本研究選用Wistar大鼠，在普通飲食基礎(chǔ)上采用大劑量阿托伐他汀鈣進(jìn)行24周的長時(shí)程干預(yù)發(fā)現(xiàn)，雖然空腹血糖阿托伐他汀鈣組與對照組無差異，但口服葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果顯示阿托伐他汀鈣組30、60、90和120 min血糖明顯升高，同時(shí)空腹和30、60、90、120 min血清胰島素水平阿托伐他汀組均低于對照組。大劑量阿托伐他汀鈣長時(shí)程干預(yù)后大鼠雖未達(dá)到臨床糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)，但提示大鼠已經(jīng)出現(xiàn)明顯的糖代謝異常，故成功建立了大劑量他汀干預(yù)誘發(fā)糖代謝異常大鼠的模型。

a.對照組；b.阿托伐他汀鈣組

圖1胰腺病理圖片HE×400

既往其他研究中心也已報(bào)道過采用不同的方法建立他汀類藥物誘發(fā)糖代謝異常的動(dòng)物模型，但是均存在不同的缺陷。有研究先采用鏈脲佐菌素?fù)p傷胰腺功能后再給予阿托伐他汀鈣或普伐他汀6周短時(shí)程干預(yù)，導(dǎo)致糖耐量受損，但不影響胰島素分泌[11]；采用小劑量阿托伐他汀鈣或普伐他汀干預(yù)3周，結(jié)果顯示阿托伐他汀鈣組胰島素敏感性降低，而普伐他汀并無此現(xiàn)象[12]，提示不同的他汀在致糖代謝異常方面可能存在異質(zhì)性。采用鏈脲佐菌素直接損傷胰腺β細(xì)胞，與2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制并不完全相同；不同的他汀類藥物因分子結(jié)構(gòu)、物理學(xué)特性、藥代學(xué)不同，所以作用存在異質(zhì)性。阿托伐他汀鈣、瑞舒伐他汀鈣、辛伐他汀、洛伐他汀和氟伐他汀對患者的糖代謝影響較大，而普伐他汀和匹伐他汀的作用結(jié)果則不同[13- 14]。強(qiáng)化他汀治療可增加新發(fā)糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，但與用藥時(shí)間的長短密切相關(guān)，同時(shí)伴隨其他危險(xiǎn)因素可能會(huì)發(fā)揮增強(qiáng)或抵消的作用。本研究選用臨床研究明確能夠增加新發(fā)糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的阿托伐他汀鈣，參考之前動(dòng)物研究[15]，劑量采用50 mg·kg-1·d-1，相當(dāng)于臨床80 mg·d-1的強(qiáng)化他汀治療，干預(yù)時(shí)間長達(dá)24周，且給予普通飲食，避免了高脂飲食本身對糖代謝的影響。本研究方案避免了既往研究的局限性，更接近人體服用阿托伐他汀鈣致糖代謝的異常病理生理過程。胰島素釋放試驗(yàn)血清胰島素水平阿托伐他汀鈣組均低于對照組，而HOMA- β、HOMA- IR降低，HOMA- IS升高，提示他汀干預(yù)后胰島素敏感性增加，改善了胰島素抵抗，出現(xiàn)糖代謝異常的原因主要為他汀致胰島β細(xì)胞功能障礙所致，這也與臨床研究[16]的結(jié)論相符。但本研究動(dòng)物模型未達(dá)到臨床糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，所以光鏡下胰腺組織病理學(xué)未見明顯變化，而僅出現(xiàn)胰島β細(xì)胞功能改變。

本研究動(dòng)物模型亦存在一定的不足：模型血糖升高水平未達(dá)到臨床糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；干預(yù)時(shí)間還不足夠長，胰腺組織病理學(xué)未見明顯變化，未進(jìn)行電鏡檢查，進(jìn)一步觀察超微結(jié)構(gòu)的變化；干預(yù)條件單一，與臨床上患者同時(shí)合并多種基礎(chǔ)疾病和危險(xiǎn)因素有所不同。

總之，本研究采用大劑量阿托伐他汀鈣進(jìn)行長時(shí)程干預(yù)，建立了阿托伐他汀鈣致糖代謝異常的大鼠模型，成功模擬人體服用阿托伐他汀鈣致糖代謝異常的病理生理過程，為深入研究他汀致糖代謝異常的分子機(jī)制提供可能性。