葉黃素對(duì)H2O2作用下MIO- M1細(xì)胞活性及遷移的影響

劉夢(mèng)璇，馬莉，何歲勤，陳文君，馬翔

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 眼科，遼寧 大連 116011)

視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜主要膠質(zhì)細(xì)胞[1]，構(gòu)成血- 視網(wǎng)膜屏障(blood- retina barrier,BRB)，對(duì)維持視網(wǎng)膜正常結(jié)構(gòu)及功能至關(guān)重要。年齡相關(guān)性黃斑變性(age- related macular degeneration,AMD)為視網(wǎng)膜黃斑區(qū)退行性改變，可導(dǎo)致視力下降[2]，主要與氧化損傷有關(guān)。氧化損傷可降低Müller細(xì)胞活性，破壞BRB完整性，導(dǎo)致AMD發(fā)生發(fā)展[3- 4]。葉黃素能猝滅氧自由基而發(fā)揮抗氧化作用。目前，對(duì)氧化損傷致AMD的研究多集中在視網(wǎng)膜色素上皮(retina pigment epithelium,RPE)細(xì)胞，而對(duì)于氧化損傷Müller細(xì)胞致AMD的報(bào)道甚少。因此，探討葉黃素保護(hù)氧化損傷Müller細(xì)胞對(duì)防治AMD至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將MIO- M1細(xì)胞(英國(guó)倫敦大學(xué)惠贈(zèng))加入DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待生長(zhǎng)至融合狀態(tài)用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2 四甲基偶氮唑鹽試劑(MTT)實(shí)驗(yàn)

將MIO- M1細(xì)胞接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、不同濃度(5、10、50、100、150、200 μmol·L-1) 過(guò)氧化氫(H2O2)組及150 μmol·L-1H2O2+不同濃度(10、20、40、60 μmol·L-1)葉黃素的共處理組。每孔加MTT液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入150 μl二甲基亞砜。置于酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度(OD)值。MIO- M1細(xì)胞活性(%)=(H2O2組或共處理組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.3 改良細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)[5]

將MIO- M1細(xì)胞接種于置有硅膠障礙物12孔板，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、不同濃度(10、20、40、60、80 μmol·L-1)H2O2組及40 μmol·L-1H2O2+不同濃度(10、20、30、40 μmol·L-1)葉黃素的共處理組。棄硅膠障礙物，于倒置顯微鏡(20倍)拍照并應(yīng)用Image J[5]檢測(cè)0、24 h細(xì)胞遷移面積。MIO- M1細(xì)胞遷移率(%)=[(0 h面積-24 h后面積)/0 h面積]×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度H2O2對(duì)MIO- M1細(xì)胞活性的影響

當(dāng)H2O2濃度為50～200 μmol·L-1時(shí)，與對(duì)照組比較，細(xì)胞活性顯著下降，分別為(84.31±2.33)%、(72.93±4.65)%、(48.12±5.64)%和(21.86±3.51)%，且不同濃度H2O2組之間MIO- M1細(xì)胞活性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。當(dāng)H2O2濃度為150 μmol·L-1時(shí)，近半數(shù)MIO- M1細(xì)胞死亡。

2.2 葉黃素對(duì)H2O2作用于MIO- M1細(xì)胞活性的保護(hù)作用

與對(duì)照組比較，H2O2組和共處理組的細(xì)胞活性顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。當(dāng)葉黃素處理濃度為40 和60 μmol·L-1時(shí)，MIO- M1細(xì)胞活性分別為(65.78±3.49)%和(73.54±5.20)%，細(xì)胞活性明顯高于H2O2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 不同濃度H2O2對(duì)MIO- M1細(xì)胞遷移的影響及葉黃素保護(hù)作用

當(dāng)H2O2處理濃度為40～80 μmol·L-1時(shí)，與對(duì)照組比較，細(xì)胞遷移率顯著下降，為(78.76±5.80)%、(57.24±2.69)%和(25.37±5.92)%，且不同濃度H2O2組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與對(duì)照組比較，H2O2組及共處理組的細(xì)胞遷移率均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，當(dāng)葉黃素處理濃度為20～40 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞遷移率為(73.85±3.77)%、(78.31±5.67)%和(82.43±4.52)%，與H2O2組比較，細(xì)胞遷移率明顯提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

A、B、C分別為對(duì)照組、H2O2組及H2O2+葉黃素共處理組棄硅膠障礙物0 h的圖像，白色虛線所圈范圍內(nèi)為無(wú)細(xì)胞區(qū)域；D、E、F為對(duì)應(yīng)組MIO- M1細(xì)胞遷移24 h后圖像(Bar=500 μm)

圖1H2O2及葉黃素對(duì)MIO-M1細(xì)胞遷移的影響

3 討 論

氧化應(yīng)激是致AMD主要原因之一，近年來(lái)對(duì)AMD探討多集中在RPE細(xì)胞受損方面，而對(duì)AMD模型研究發(fā)現(xiàn)，氧化損傷可致Müller細(xì)胞受損，使其活性下降并破壞BRB的完整性，進(jìn)而導(dǎo)致AMD發(fā)生發(fā)展[3- 4]。作者通過(guò)體外給予H2O2，建立MIO- M1細(xì)胞氧化損傷模型，觀察氧化損傷MIO- M1細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，隨H2O2濃度不斷增加，MIO- M1細(xì)胞活性逐漸下降，呈劑量依賴性，且當(dāng)H2O2濃度為150 μmol·L-1時(shí)，可致接近半數(shù)的MIO- M1細(xì)胞死亡，有力支持了H2O2可降低細(xì)胞活性的報(bào)道[6]。給予葉黃素干預(yù)后可顯著提高M(jìn)IO- M1細(xì)胞活性，進(jìn)一步驗(yàn)證了楊旭等[7]提出的葉黃素可保護(hù)Müller細(xì)胞活性的觀點(diǎn)。然而，對(duì)肝癌的研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素可降低肝癌HepG2細(xì)胞的存活率[8]，這一不同可能是由癌細(xì)胞與MIO- M1細(xì)胞生長(zhǎng)特性不同及對(duì)藥物敏感度的差異性所致。本研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素對(duì)H2O2氧化損傷MIO- M1細(xì)胞具有保護(hù)作用，這與葉黃素在機(jī)體中發(fā)揮抗氧化及抗凋亡作用密切相關(guān)。

由于經(jīng)典細(xì)胞劃痕法存在局限性，本研究采用改良細(xì)胞劃痕法[5]檢測(cè)MIO- M1細(xì)胞的遷移率，使結(jié)果更為精準(zhǔn)，且操作便捷。遷移是細(xì)胞對(duì)周?chē)h(huán)境變化的一種基本反應(yīng)，對(duì)受損組織的修復(fù)及再生具有重要作用。已有研究[9]顯示，Müller細(xì)胞可遷移至受損部位再生，以修復(fù)、重建受損的視網(wǎng)膜。Sullivan等[4]對(duì)AMD研究發(fā)現(xiàn)，Müller細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞遷移延伸拓展至脈絡(luò)膜，修復(fù)受損的BRB，維護(hù)其完整性并保證視網(wǎng)膜正常結(jié)構(gòu)及功能。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2對(duì)MIO- M1細(xì)胞遷移的抑制作用隨H2O2濃度增加而增強(qiáng)，呈劑量依賴性。加入20 μmol·L-1葉黃素干預(yù)后可顯著提高M(jìn)IO- M1細(xì)胞遷移率，對(duì)AMD起防治作用。Liu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素可下調(diào)細(xì)胞周期蛋白B1的表達(dá)，抑制氧活性(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，保護(hù)RPE細(xì)胞，而ROS能夠損傷線粒體,阻止ATP產(chǎn)生[11]。麥嘉儀等[12]研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素可降低ROS，提高Na+- K+- ATP酶活性，促進(jìn)ATP產(chǎn)生。因此，我們推測(cè)葉黃素可能通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白B1，提高Na+- K+- ATP酶活性，抑制ROS并促進(jìn)ATP產(chǎn)生，從而保護(hù)了MIO- M1細(xì)胞活性及遷移。

綜上所述，本研究表明葉黃素對(duì)H2O2作用下MIO- M1細(xì)胞活性及遷移具有一定保護(hù)作用，并對(duì)防治AMD至關(guān)重要，但其確切保護(hù)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。