UPLC-MS/MS快速測定煙草中2,4-滴和2,4,5-涕

楊 飛，劉珊珊，鄧惠敏，邊照陽，李中皓，范子彥，王 穎，唐綱嶺

國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

2,4-滴和2,4,5-涕是氯代苯氧羧酸類除草劑，廣泛施用于禾谷類作物田、針葉樹林和牧草場等，由于其價(jià)格低廉、除草速度較快、除草譜較寬等優(yōu)點(diǎn)，在生產(chǎn)中一直發(fā)揮重要的作用［1-2］。2,4-滴、2,4,5-涕均為低毒除草劑，通過植物葉面、莖稈和根系吸收傳導(dǎo)，阻礙植物激素的正常傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致其死亡。但在使用過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)此類物質(zhì)可以引起人類軟組織惡性腫瘤，并且對(duì)動(dòng)物體具有胎盤毒性。該類化合物因具有較高的水溶性和遷移性，在煙草生長過程中會(huì)被吸收并保留在煙葉中，從而對(duì)吸煙者的健康構(gòu)成威脅［3-4］。2016年，國際煙草科學(xué)研究合作中心（CORESTA）農(nóng)用化學(xué)品咨詢委員會(huì)（ACAC）制定了106種農(nóng)用化學(xué)品指導(dǎo)性殘留限量（GRL）清單，將煙草中2,4-滴和2,4,5-涕的殘留量上限分別定為0.20和0.05 mg/kg。

2,4-滴和2,4,5-涕可以通過毛細(xì)管電泳［5］、液相色譜-紫外檢測器［6-7］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）［8-12］、氣相色譜（GC）［13-14］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）［15-21］多種方法檢測。由于該類農(nóng)藥難以氣化，采用GC、GC-MS方法分析時(shí)，必須先將該類農(nóng)藥用重氮甲烷、五氟芐基溴或三甲基硅烷衍生化為易氣化的物質(zhì)。衍生化后，方法的靈敏度得以大幅提高，但重氮甲烷和三甲基硅烷等衍生化試劑具有較強(qiáng)毒性，而且衍生化過程操作繁瑣，耗時(shí)較長。普通液相色譜由于靈敏度低，無法滿足限量要求，因此應(yīng)用相對(duì)較少。近年來，隨著LC-MS/MS選擇性、靈敏度以及抗基質(zhì)干擾能力的提高，采用LC-MS/MS對(duì)各類農(nóng)藥進(jìn)行分析的文獻(xiàn)報(bào)道逐年增多［8,22-25］，其中Koesukwiwat等［8］、Yang 等［24］和 Liu 等［25］采 用 QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）方法分別對(duì)稻米和煙草中的2,4-滴和2,4,5-涕進(jìn)行了提取和LC-MS/MS直接測定，該方法無需衍生化，簡化了樣品前處理過程。但是采用QuEChERS方法時(shí)，基質(zhì)中的極性和非極性共提取物容易對(duì)目標(biāo)物造成干擾，影響定性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，在煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 181—2004《煙草及煙草制品 有機(jī)氯除草劑農(nóng)藥殘留量的測定 氣相色譜法》［21］的基礎(chǔ)上進(jìn)行方法改進(jìn)，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)簡化煙草中2,4-滴和2,4,5-涕的檢測過程，旨在為不同類型煙草樣品中2,4-滴和2,4,5-涕的快速測定提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

30個(gè)煙葉樣品全部來自2017年度國家煙草專賣局農(nóng)殘普查分析樣品，烤煙、白肋煙和香料煙各10個(gè)?？瞻卓緹煛⒖瞻紫懔蠠熀涂瞻装桌邿煒悠犯?個(gè)。所有樣品烘烤后粉碎，過2 mm（10目）篩后置于棕色玻璃瓶中，于4℃下保存。

2,4-滴和2,4,5-涕農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（＞98.0%，德國Augsburg公司）；二氯甲烷、甲醇（色譜純，德國Merck公司）；鹽酸（37%，體積分?jǐn)?shù)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；水為超純水。

Waters TQS四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀［配備電噴霧電離源（ESI）］、Waters Acquity I Class超高效液相色譜儀、ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm,1.7 μm）（美國Waters公司）；VX200渦旋振蕩儀（美國Labnet公司）；Turbo Vap氮吹儀（美國Biotage公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；AEl63電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 空白基質(zhì)提取液的制備

稱取2.0 g空白煙葉樣品于50 mL帶蓋離心管中，加入20 mL 0.5 mol/L鹽酸水溶液和20 mL CH2Cl2，渦旋振蕩15 min；移取下層有機(jī)相至儲(chǔ)液瓶中備用，即為空白基質(zhì)提取液。

1.2.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別稱取25 mg 2,4,5-涕以及100 mg 2,4-滴農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，于同一個(gè)100 mL容量瓶中用甲醇定容，制得2,4,5-涕質(zhì)量濃度為250 μg/mL，2,4-滴質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的一級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

移取100 μL一級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到2,4,5-涕質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL，2,4-滴質(zhì)量濃度為 1.0 μg/mL 的二級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

分別移取二級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 000、500、250、100、50 μL至5個(gè)5 mL容量瓶中，用烤煙的空白基質(zhì)提取液稀釋并定容，制得不同質(zhì)量濃度的烤煙基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。烤煙基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中 2,4,5-涕的質(zhì)量濃度分別為 50、25、12.5、5.0、2.5 ng/mL；2,4-滴的質(zhì)量濃度為 200、100、50、20、10 ng/mL。

白肋煙和香料煙基質(zhì)效應(yīng)與烤煙不同，因此在實(shí)驗(yàn)中白肋煙和香料煙對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)分別用其空白基質(zhì)提取液稀釋。

1.2.3 樣品的前處理

稱取1.0 g粉碎后的樣品于50 mL帶蓋離心管中，加入10 mL 0.5 mol/L鹽酸水溶液和10 mL CH2Cl2，渦旋振蕩15 min；移取1 mL下層有機(jī)相，氮吹近干后用1 mL甲醇復(fù)溶，進(jìn)行UPLC?MS/MS檢測。檢測條件為：

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）柱；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.2 mL/min；流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0~5.0 min為 10%A~90%A，5.0~8.0 min為 90%A，8.0~8.1 min為90%A~10%A，8.1~10.0 min為10%A；質(zhì)譜掃描方式：負(fù)離子掃描；離子源：電噴霧電離源（ESI）；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：450℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；停留時(shí)間：100 ms；毛細(xì)管電壓：3.0 KV；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

分別考察水、甲醇、乙腈及其不同比例混合物對(duì)2種苯氧羧酸類農(nóng)藥分離的影響。結(jié)果表明，甲醇和乙腈對(duì)2種農(nóng)藥的分離效果相近，考慮到乙腈的毒性較甲醇大，因此選用甲醇-水作為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)考察了甲酸對(duì)2種農(nóng)藥電離效果的影響，結(jié)果表明，在流動(dòng)相中加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸后兩種農(nóng)藥的信號(hào)明顯降低，但是色譜峰形得到明顯改善。原因是：2,4-滴和2,4,5-涕為酸性化合物，在酸性介質(zhì)中其電離受到抑制，從而使方法的檢出限降低。由于在流動(dòng)相中加入少量有機(jī)酸可以使目標(biāo)物在經(jīng)過色譜柱時(shí)以分子形式存在，改善其在色譜柱上的保留情況，因此選擇甲醇-水（0.1%甲酸）為流動(dòng)相。采用優(yōu)化后的梯度洗脫程序?qū)?種農(nóng)藥進(jìn)行分析，其選擇離子色譜圖如圖1所示。可以看出，2種農(nóng)藥的分離效果較好。

圖1 2,4-滴和2,4,5-涕的選擇離子色譜圖Fig.1 SIM chromatogram of 2,4?D and 2,4,5?T

2.1.2 質(zhì)譜條件的確定

取200 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，以蠕動(dòng)注射進(jìn)樣方式在ESI+和ESI-模式下進(jìn)行全掃描。結(jié)果顯示，在負(fù)離子（ESI-）模式下，［M-H］-和［M-H+2］-豐度較高，因此選擇［M-H］-為定量離子的母離子，［M-H+2］-為定性離子的母離子。以［M-H］-和［M-H+2］-為前體離子，進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，選取豐度較強(qiáng)、信號(hào)穩(wěn)定的碎片離子作為定性和定量離子。最后，優(yōu)化毛細(xì)管電壓、離子源溫度、錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù)條件，使各個(gè)離子對(duì)的信號(hào)響應(yīng)最高。優(yōu)化確定的2種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 2,4-滴和2,4,5-涕的質(zhì)譜參數(shù)①Tab.1 MS parameters for 2,4?D and 2,4,5?T

2.1.3 萃取溶劑及其體積的確定

針對(duì)苯氧羧酸類農(nóng)藥的極性和溶解度，選取不溶于水的二氯甲烷、甲苯和乙酸乙酯作為萃取溶劑。在加入10 mL鹽酸水溶液提取后，分別加入10、20、30 mL的二氯甲烷、甲苯或乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取結(jié)果如表2所示。在3種有機(jī)溶劑中，當(dāng)溶劑體積為10 mL時(shí)，甲苯的萃取效果與二氯甲烷接近，但甲苯對(duì)目標(biāo)物色譜峰形影響較大，峰展寬現(xiàn)象較嚴(yán)重，且出現(xiàn)峰分裂現(xiàn)象；加入二氯甲烷后，樣品譜圖中目標(biāo)物的峰形較好，且雜質(zhì)峰較少。綜上考慮，選擇二氯甲烷作為萃取溶劑。

當(dāng)1.0 g烤煙、白肋煙和香料煙樣品中2種農(nóng)藥的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為5倍GRL（指導(dǎo)性農(nóng)藥殘留限量）值時(shí)，使用10 mL二氯甲烷的平均回收率均大于90%；進(jìn)一步增加有機(jī)溶劑體積時(shí)，萃取效率基本不變，但檢測靈敏度下降，因此選擇二氯甲烷的體積為10 mL。

表2 萃取溶劑在不同萃取比例下的萃取效率Tab.2 Effects of extraction agents on recoveries of 2,4,5?T and 2,4?D at different volume ratios

2.1.4 HCl濃度的確定

HCl的濃度會(huì)影響到苯氧羧酸類農(nóng)藥的質(zhì)子化效果，從而影響其提取效果。在1.0 g烤煙、白肋煙和香料煙樣品中2種農(nóng)藥的含量為5倍GRL濃度水平上，分別比較了0.25、0.5、1.0 mol/L HCl水溶液對(duì)2種農(nóng)藥的提取效果。結(jié)果（圖2）顯示，用0.5和1.0 mol/L HCl水溶液提取時(shí)，平均回收率相當(dāng)，但用1.0 mol/L HCl水溶液時(shí)樣品提取液的顏色較深，基質(zhì)干擾較大，因此選擇0.5 mol/L HCl水溶液作為提取溶劑。

圖2 HCl濃度對(duì)提取效率的影響Fig.2 Effect of HCl concentration on recovery

2.1.5 振蕩時(shí)間的確定

振蕩提取是液-液萃取分析的重要環(huán)節(jié)之一。在1.0 g烤煙、白肋煙和香料煙樣品中2種農(nóng)藥的含量為5倍GRL濃度水平上，采用3種振蕩萃取時(shí)間，即渦旋劇烈振蕩5、15和30 min，比較振蕩時(shí)間對(duì)回收率的影響。結(jié)果（圖3）顯示，振蕩萃取5 min時(shí)平均回收率較低。為了提高檢測效率，且不影響回收率，選擇渦旋振蕩15 min。

2.1.6 基質(zhì)效應(yīng)的考察

在樣品提取過程中，提取液中的共提物會(huì)影響目標(biāo)物的定性、定量分析結(jié)果，這種現(xiàn)象稱之為基質(zhì)效應(yīng)。通常，通過配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液來解決基質(zhì)效應(yīng)問題。為了考察不同基質(zhì)對(duì)各種除草劑響應(yīng)的影響，分別用白肋煙、香料煙、烤煙的空白提取液配制50 ng/mL溶液，將其響應(yīng)值與利用甲醇配制的同濃度溶液的響應(yīng)值進(jìn)行對(duì)比。各樣品中目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)強(qiáng)度的比值如表3所示。可以看出，不同類型的煙草樣品基質(zhì)對(duì)2種目標(biāo)物的響應(yīng)信號(hào)均有不同程度的抑制作用。因此，為了避免基質(zhì)效應(yīng)給定量結(jié)果帶來干擾，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)于不同類型的煙草樣品，采用其對(duì)應(yīng)的空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

圖3 振蕩時(shí)間對(duì)回收率的影響Fig.3 Effect of oscillation time on recovery

表3 不同類型煙草的基質(zhì)效應(yīng)Tab.3 Matrix effects of different types of tobacco samples

2.2 方法評(píng)價(jià)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

以各農(nóng)藥定量離子對(duì)的色譜峰面積（Y，cps）為縱坐標(biāo)，濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。分別以3倍和10倍信噪比（S/N）確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果（表4）顯示，2個(gè)目標(biāo)物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)高于0.999，可以滿足定量分析要求。

2.2.2 方法的回收率及精密度

通過加標(biāo)樣品的回收率實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該方法的重復(fù)性及精密度（RSD）。采用不同濃度水平（LOQ，GRL，5倍GRL）的加標(biāo)樣品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。每個(gè)濃度水平進(jìn)行5次平行測定，計(jì)算樣品中2種除草劑的回收率和RSD。結(jié)果（表5）顯示，3種不同類型煙草樣品的回收率分別為80.4%~94.6%、80.8%~92.6%和79.5%~94.4%，且RSD均小于6.0%。

表4 2,4-滴和2,4,5-涕的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Tab.4 Standard working curves,correlation coefficients,LODs and LOQs of 2,4-D and 2,4,5-T

表5 不同煙葉中2,4-滴和2,4,5-涕的回收率和精密度（n=5）Tab.5 Recoveries and precisions of 2,4?D and 2,4,5?T in different tobaccos（n=5）

2.2.3 與現(xiàn)有方法的對(duì)比

煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) YC/T 181—2004［21］采用三甲基氫氧化硫?qū)⒈窖豸人犷愞r(nóng)藥衍生化為相應(yīng)的甲酯，然后進(jìn)行GC-MS檢測。采用本方法對(duì)烤煙、白肋煙和香料煙樣品各10個(gè)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，僅4個(gè)樣品中檢出2,4-滴或2,4,5-涕，其余樣品均未檢出2種目標(biāo)物。采用本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)4個(gè)含有目標(biāo)物的煙草樣品進(jìn)行檢測和對(duì)比分析，結(jié)果（表6）顯示，本方法檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果之間無明顯差異，說明兩種方法的一致性良好。

表6 不同方法的測定結(jié)果對(duì)比①Tab.6 Comparison of testing results of different methods（mg·kg-1）

2.2.4 能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采取盲樣測試的方式進(jìn)行FAPAS（Food Analysis Performance Assessment Scheme）國際能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。各實(shí)驗(yàn)室按照自建方法對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析。在2018年FAPAS國際能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，采用本方法對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析。樣品為白肋煙，2,4-滴的設(shè)計(jì)值是0.50 mg/kg。各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果如表7所示。本實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果為0.59 mg/kg，Z值為1.0，說明檢測能力令人滿意。

表7 能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of capability verification experiment

3 結(jié)論

通過優(yōu)化質(zhì)譜條件、色譜條件及樣品前處理過程等，建立了快速測定煙草中2,4-滴和2,4,5-涕兩種氯代苯氧羧酸類除草劑的UPLC-MS/MS方法。在本實(shí)驗(yàn)條件下，2,4-滴和2,4,5-涕的回收率在79.5%~94.6%之間，RSD在3.8%~5.9%之間，與煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法相比，結(jié)果無明顯差異。FAPAS國際能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法可用于盲樣的準(zhǔn)確定性定量分析。本方法以空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，前處理簡單快速，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于煙草中該類農(nóng)藥殘留的分析。