甲氨蝶呤通過抑制Wnt/β-catenin信號通路誘導小鼠腸道損傷

黃登桂 周加義 秦穎超 王修啟

(華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院廣東省動物營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室國家生豬種業(yè)工程技術研究中心，廣東廣州510642)

畜牧生產(chǎn)中，斷奶仔豬腹瀉一直是導致其死亡率居高不下的重要原因之一。仔豬腹瀉問題給畜牧業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失，農(nóng)業(yè)部數(shù)據(jù)顯示，2016年我國新生活仔豬8.79億頭，其中1.52億頭因腹瀉等疾病在斷奶前后死亡或淘汰。研究表明，甲氨蝶呤（metho?trexate，MTX）作為一種抗葉酸藥，可抑制DNA的合成，并干擾RNA的轉錄和蛋白質(zhì)的翻譯[1]。新陳代謝旺盛的腸上皮對外源刺激非常敏感，MTX損傷消化道黏膜的具體表現(xiàn)為：黏膜腺體排列不齊或崩壞，絨毛變短，部分斷裂、脫落，腸壁水腫[2]，進而導致腸道營養(yǎng)吸收能力下降，屏障功能被破壞，腸道微生物區(qū)系失衡，機體發(fā)生腹瀉[3-4]。Wnt/β-catenin信號通路對腸上皮更新至關重要，其活性過高或過低均會導致腸上皮穩(wěn)態(tài)失衡[5]。由于目前關于MTX誘發(fā)腸上皮更新障礙分子機制仍不清晰，因此有必要進一步探索病理狀態(tài)下腸黏膜的穩(wěn)態(tài)情況，從而為畜牧生產(chǎn)過程中幼畜腹瀉的預防或治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甲氨蝶呤：純度≥98%（大連美侖生物技術有限公司）。

1.2 試驗動物和細胞

昆明小鼠：購至廣東省醫(yī)學實驗動物中心；CMT-93細胞：由南京農(nóng)業(yè)大學庾慶華教授團隊贈予。

1.3 試驗設計

選擇體重相近的5～6周齡左右的昆明小鼠（公）64只，隨機分為兩組，兩組之間體重無顯著差異（P＞0.05），每組32個重復，每個重復1只小鼠。各組小鼠自由飲水、采食。兩組分別注射生理鹽水和50 mg/kg BW MTX溶液，連續(xù)注射2 d，第二次注射后72 h處死小鼠，進行樣品采集。試驗期間每日記錄料耗、飲水和體重，計算小鼠的日平均采食量、日飲水量和日增重。

將接種的CMT-93細胞置于37℃、飽和濕度、95%空氣+5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入0、0.025、0.05、0.10 μM和0.20 μM MTX進行處理。

1.4 樣品收集

采用頸椎脫臼法處死小鼠后，剖開腹腔，分離十二指腸、空腸和回腸，測量各腸段長度，去除內(nèi)容物，洗凈后稱量重量，單位長度腸重（mg/cm）=腸道重量/腸道長度。分別采集各腸段樣品兩份，一份保存于4%多聚甲醛中，另一份保存于-80℃冰箱中備用。

去除培養(yǎng)板里的細胞培養(yǎng)液，用預冷的PBS清洗2次，加入200μl RIPA裂解液，12 000 r/min離心10 min，取上清，用BCA法測定樣品蛋白質(zhì)濃度，消煮后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 腸道形態(tài)學觀察

將小鼠腸道經(jīng)乙醇逐級脫水、二甲苯透明、透蠟、包埋、切片（5μm）和H&E染色后，光鏡下觀察小鼠腸道黏膜的形態(tài)結構，每只小鼠取2張H&E染色切片，每張切片選5個視野拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件測量每張照片中5根最長絨毛處的絨毛高度及隱窩深度。腸絨毛高度指從腸腺絨毛聯(lián)結處到絨毛頂端的高度，隱窩深度指從腸腺基部到腸腺絨毛聯(lián)結處的高度。

1.6 MTT法

取處于生長對數(shù)期的細胞以2×103個/孔接種于96孔板中，分別用不同濃度的MTX處理，并于處理后0、24、48 h和72 h，隨機取一塊96孔板，每孔加入20μl MTT工作液，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h；吸干孔中的培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，在搖床上100 r/min搖晃30 min，使其充分混勻；選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值，即A490處的OD值，最后以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.7 CMT-93跨膜電阻測定

分別往transwell上室和下室中加入100μl和600μl的完全培養(yǎng)基，用電阻儀測定其電阻值，記錄為該transwell的本底電阻值。吸除上室的培養(yǎng)基，加入100 μl濃度為1×107cells/ml的CMT-93細胞，隔天更換上室和下室的培養(yǎng)基，每天測定其跨膜電阻，至跨膜電阻值穩(wěn)定，加入MTX孵育24 h測定跨膜電阻值。細胞跨膜電阻值=（測定值-本底值）×培養(yǎng)面積，細胞跨膜電阻比率（%，baseline）=處理組細胞跨膜電阻值/對照組細胞跨膜電阻值×100。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡

組織和細胞蛋白質(zhì)樣品經(jīng)電泳、轉膜、封閉、顯色、一抗孵育、二抗孵育后，在FluorChem M apparatus凝膠成像儀中捕捉膜上條帶信息，并用Image J2x軟件統(tǒng)計條帶灰度值。蛋白質(zhì)相對表達量=總蛋白質(zhì)/β-actin。

1.9 數(shù)據(jù)處理

結果以“平均值±標準誤”表示，數(shù)據(jù)處理與分析采用SAS 9.2的GLM程序進行，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 小鼠生長性能（見表1）

表1 MTX對小鼠生長性能的影響

表1可見，與對照組比較，腹腔注射50 mg/kg BW MTX顯著降低小鼠平均日采食量、平均日飲水量和平均日增重（P＜0.05），其中平均日采食量降低了33.81%，平均日飲水量降低了32.88%，平均日增重降低74.45%。

2.2 小鼠單位長度腸重(見表2)

表2 MTX對小鼠單位長度腸重的影響(mg/cm)

由表2可知，MTX顯著降低了小鼠的十二指腸、空腸和回腸單位長度腸重（P＜0.05），其中十二指腸降低了14.45%，空腸降低了28.14%，回腸降低了15.17%。

2.3 小鼠空腸形態(tài)學

由圖1可見，MTX可導致空腸絨毛嚴重萎縮，絨毛變短，固有層裸露，黏膜隱窩明顯增生。

圖1 MTX對空腸形態(tài)結構的影響

表3可知，與對照組相比，MTX組小鼠空腸絨毛高度顯著降低，隱窩深度顯著增加，絨毛高度與隱窩深度的比值顯著降低（P＜0.05）。

表3 MTX對小鼠腸道黏膜指數(shù)的影響

2.4 CMT-93細胞增殖活力

不同濃度MTX對CMT-93細胞增殖活力的影響見圖2。由圖可知，0.025、0.05、0.10、0.20 μM MTX處理24 h即可顯著降低細胞增殖活力（P＜0.05），且這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.5 CMT-93細胞跨膜電阻值測定

CMT-93細胞跨膜電阻值（TEER）測定結果見圖3。0.025、0.05μM MTX處理24 h顯著降低了CMT-93細胞跨膜電阻值（P＜0.05）。

2.6 緊密連接蛋白表達

由圖4可知，與對照組相比，MTX組小鼠空腸和CMT-93細胞中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達顯著降低（P＜0.05）。

2.7 β-catenin、PCNA和Caspase-3蛋白質(zhì)表達

由圖5可知，MTX顯著降低了小鼠空腸和CMT-93細胞中β-catenin和PCNA蛋白質(zhì)表達（P＜0.05），增加了Caspase-3的表達（P＜0.05）。

3 討論

3.1 MTX對小鼠生長性能的影響

研究表明，MTX可誘導系列活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）的產(chǎn)生，促進中性粒細胞浸潤到小腸組織，減少腸上皮細胞內(nèi)谷胱甘肽（Glutathione,GSH）的含量，升高腸道黏膜中丙二醛（Malondialde?hyde,MDA）的含量，從而導致腸黏膜炎癥[6]，而急性腸黏膜炎可引起小鼠采食量急劇下降或不食，體重降低。此外，MTX還會降低小腸上的乳糖酶和麥芽糖酶活性，導致營養(yǎng)物質(zhì)無法被充分消化吸收，進而降低動物的生長性能[7-8]。與此相似，本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射MTX會導致其采食量、飲水量和日增重降低。

圖2 MTX對CMT-93細胞增殖活力的影響

3.2 MTX對腸道黏膜指數(shù)的影響

腸道是消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要場所，也是維持體內(nèi)平衡的重要屏障。腸道完整性被破壞后，不僅會引起營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收障礙，使大量營養(yǎng)物質(zhì)在后腸堆積，引發(fā)異常發(fā)酵，誘導動物腹瀉，而且會導致有害菌的遷移和移位[8-9]。大量研究結果表明，MTX能造成腸黏膜缺失，絨毛萎縮、脫落，隱窩形態(tài)喪失，黏膜腺體排列不均勻，杯狀細胞減少甚至消失，腸微絨毛變細、稀疏，高爾基復合體水腫擴張，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫大[10-13]。本試驗結果表明，給小鼠注射MTX會導致其十二指腸、空腸和回腸單位長度重量顯著降低，腸道黏膜形態(tài)被破壞，絨毛高度降低，隱窩增生明顯，上皮細胞脫落、壞死。

圖3 MTX對CMT-93細胞跨膜電阻的影響

圖4 MTX對小鼠空腸和CMT-93細胞中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達的影響

3.3 MTX對腸道屏障功能的影響

腸道上皮屏障的完整結構是由腸道上皮細胞與相鄰細胞之間的緊密連接組成的，緊密連接對黏膜屏障功能和腸滲透性起到關鍵作用[14]。其中閉合小環(huán)蛋白ZO是緊密連接支持結構的基礎，跨膜蛋白Oc?cludin是緊密連接的結構骨架。研究表明Occludin敲除鼠雖然腸上皮形態(tài)結構表現(xiàn)正常，但是連接的完整性降低[15]。Hamada K等[16]和何秋穎等[9]發(fā)現(xiàn)，MTX顯著減少了大鼠空腸上皮ZO-1的分布，降低了腸黏膜組織中Occludin mRNA及蛋白表達水平。而腸上皮跨膜電阻值降低和通透性增加與ZO-1和Occludin的表達及細胞內(nèi)分布的改變有關，MTX可顯著增加大鼠腸道對FD4的透過率[16]和血漿中D-乳酸的含量[17]，說明腸黏膜通透性發(fā)生了改變，與本研究中MTX降低CMT-93細胞TEER值一致。

3.4 MTX對小鼠腸上皮更新的影響及其機理

Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控細胞的增殖過程影響腸上皮的發(fā)育[18-19]，同時還能通過抑制c-Myc誘導Caspase的釋放，從而達到抑制凋亡的作用[20]。βcatenin是Wnt信號通路下游最主要的信號因子，βcatenin可調(diào)控其下游靶基因Cyclin D1，促進細胞增殖[21]。而細胞增殖和凋亡之間的穩(wěn)態(tài)平衡對于小腸的生理和結構屏障功能的維持是必需的，這種平衡遭到破壞時將會引起腸上皮萎縮。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是小鼠空腸組織還是CMT-93細胞，MTX均可降低βcatenin和增殖細胞標志PCNA蛋白質(zhì)表達，增加細胞凋亡執(zhí)行者Caspase-3表達，表明MTX降低Wnt/βcatenin信號通路活性，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，破壞腸上皮更新進程。

4 結論

圖5 MTX對小鼠空腸和CMT-93細胞中β-catenin、PCNA和Caspase-3蛋白質(zhì)表達的影響

①腹腔注射甲氨蝶呤可顯著降低小鼠生長性能，損傷腸道黏膜結構。

② MTX降低Wnt/β-catenin信號通路活性，抑制腸上皮細胞增殖，促進其凋亡，破壞腸道屏障功能。