日糧纖維調(diào)節(jié)豬腸道微生物和腸黏膜屏障功能的研究進(jìn)展

張宏福 吳維達(dá) 張 莉 解競(jìng)靜 陳 亮

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

我國(guó)是養(yǎng)豬大國(guó)，生豬飼養(yǎng)量占世界總量50%以上；也是豬肉消費(fèi)大國(guó)，豬肉占國(guó)內(nèi)肉食類(lèi)消費(fèi)量的60%以上。但我國(guó)并不是養(yǎng)豬強(qiáng)國(guó)，每頭母豬每年所能提供的斷奶仔豬頭數(shù)平均僅為17～18頭，遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國(guó)家23～24頭的平均水平。斷奶仔豬死亡是制約我國(guó)生豬養(yǎng)殖水平的最重要原因之一，每年約有1.6億頭仔豬由于腹瀉而死亡。生產(chǎn)上通常使用抗生素及高銅、高鋅來(lái)控制仔豬腹瀉，但養(yǎng)殖糞污排放造成的抗生素及重金屬污染帶來(lái)的一系列環(huán)境問(wèn)題已經(jīng)危及人類(lèi)健康安全[1-2]，禁抗、限制使用高銅、高鋅已經(jīng)成了行業(yè)普遍共識(shí)。十三五期間，習(xí)近平總書(shū)記提出了“綠色”發(fā)展理念，調(diào)整畜牧業(yè)結(jié)構(gòu)，降低養(yǎng)殖污染，發(fā)展綠色畜牧業(yè)是時(shí)代的要求和大趨勢(shì)[3]。2017年，農(nóng)業(yè)部已經(jīng)禁止高銅、高鋅在生豬上的使用，并且我國(guó)養(yǎng)殖促生長(zhǎng)抗生素禁止使用的腳步越來(lái)越近。因此迫切需要新型飼料添加劑替代抗生素或高銅、高鋅，改善仔豬腸道健康，實(shí)現(xiàn)生豬養(yǎng)殖綠色發(fā)展的產(chǎn)業(yè)技術(shù)升級(jí)。

斷奶仔豬腹瀉的成因較為復(fù)雜，國(guó)際上普遍公認(rèn)的是“過(guò)敏理論”，其原理為：過(guò)敏-腸道屏障受損-病原菌侵入-腹瀉。腸道屏障功能是建立在日糧、腸道微生物、黏膜層三者之間動(dòng)態(tài)平衡的基礎(chǔ)上，但該平衡十分脆弱[4-5]。因此，提高腸道屏障功能是有效控制仔豬腹瀉的關(guān)鍵。日糧纖維（Dietary fiber，DF）是不能被人和動(dòng)物分泌的消化酶所消化的碳水化合物總稱(chēng)，包含菊粉、果膠、微晶纖維素、抗性淀粉、β-葡聚糖等[6]。大量研究表明，DF可以被腸道微生物利用生成短鏈脂肪酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具備刺激腸道發(fā)育，優(yōu)化腸道微生物區(qū)系，改善腸道屏障功能，影響機(jī)體代謝、動(dòng)物行為甚至認(rèn)知水平等功能[7-8]。近年研究還發(fā)現(xiàn)某些DF（如菊粉）還具有免疫調(diào)節(jié)功能[9-12]。因此，日糧添加DF可能是控制仔豬腹瀉的綠色途徑。

圖1 DF的分析分類(lèi)

1 DF的含義及理化性質(zhì)

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，動(dòng)物飼糧中的粗纖維會(huì)“降低消化率，稀釋日糧養(yǎng)分并且降低動(dòng)物的生產(chǎn)性能”。但是粗纖維組成分析基本上是測(cè)定酸和堿水解后的殘留量[13]。此種方法測(cè)定的纖維素占50%～80%，木質(zhì)素占10%～50%，半纖維素占20%左右。由于植物細(xì)胞壁基礎(chǔ)組分差異較大，所以粗纖維與DF之間并無(wú)固定的比例關(guān)聯(lián)關(guān)系。由于結(jié)構(gòu)上以及生理上的多樣性，至今未有DF準(zhǔn)確的定義。CODEX(Codex Alimen?tarius Commision，2009)、國(guó)際的權(quán)威機(jī)構(gòu) EU(2008)、IOM(2001)以及AACC(2000)均對(duì)DF進(jìn)行了定義，這些定義區(qū)別主要在于對(duì)碳水化合物中單體的聚合度，以及人工合成類(lèi)似物上的涵蓋存在一定的差異，但是共同點(diǎn)在于都將DF歸納為不可被動(dòng)物/人內(nèi)源消化酶消化的一類(lèi)碳水化合物聚合物[14]。

植物源性飼料原料的細(xì)胞壁含有豐富的DF。超過(guò)90%的植物細(xì)胞壁都是由非淀粉多糖組成，其中又以纖維素、半纖維素以及果膠最為豐富。其他少量的非淀粉多糖主要包括果聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、植物黏液、β-葡聚糖以及樹(shù)膠。DF的分析方法主要有兩類(lèi)：一類(lèi)是酶化學(xué)法(Englyst法)、另一類(lèi)是酶或非酶重量分析法AOAC（美國(guó)分析化學(xué)協(xié)會(huì))法包括酶-重量法、酶-分光光度法、酶-HPLC法、酶-GC等。從涵蓋的DF組分上講，Englyst法認(rèn)定的DF只包含非淀粉多糖（NSP），而AOAC法不僅包括NSP還包括抗性淀粉及木質(zhì)素，更具代表性（見(jiàn)圖1）[15]。

DF的主要理化性質(zhì)包括水合作用、發(fā)酵性能及黏性等。根據(jù)這三種性質(zhì)又可將其劃分為不同纖維類(lèi)型[16]。DF的理化性質(zhì)對(duì)腸道的生理功能發(fā)揮著重要作用[17]。

1.1 水合作用

水合作用主要包括水溶性、吸水力以及持水力三方面，反映的不是纖維溶于水的能力而是纖維將水整合進(jìn)入其基質(zhì)形成膠狀懸浮體的能力[18]。其中水溶性主要取決于纖維形成的多聚糖種類(lèi)以及之間的化學(xué)鍵。例如纖維素、β-葡聚糖分別由β-1，4-糖苷鍵、β-1，6-糖苷鍵連接形成不可溶性、可溶性纖維。其中不溶性纖維包括纖維素、木質(zhì)素及部分半纖維素等，而可溶性纖維包括果膠、菊粉、葡聚糖以及阿拉伯木聚糖等。

1.2 發(fā)酵性能

由于發(fā)酵產(chǎn)物短鏈脂肪酸的生成，纖維的發(fā)酵性能一般促進(jìn)腸道健康。不同類(lèi)型DF發(fā)酵程度變異很大，從基本不發(fā)酵的木質(zhì)素至發(fā)酵完全的果膠。纖維的發(fā)酵部位主要是后腸，快速發(fā)酵的纖維（可溶性）可被大腸菌群迅速發(fā)酵生成短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids,SCFAs），而慢速或者不完全發(fā)酵的纖維（不可溶性）可通過(guò)促進(jìn)排便，縮短食糜在腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間并增加糞便重量改善腸道健康；不同來(lái)源的纖維發(fā)酵生成的短鏈脂肪酸種類(lèi)和濃度完全不同[6，19-20]。

1.3 黏性

黏性是影響纖維生理功能的另一重要的理化性質(zhì)，傳統(tǒng)的動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)觀念認(rèn)為高黏性DF會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，增加能量消耗，降低飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。一般可溶性纖維較不可溶纖維的黏性更強(qiáng)，長(zhǎng)鏈纖維比短鏈更易形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因而一般長(zhǎng)鏈纖維較短鏈纖維黏性更強(qiáng)[21]。黏性纖維包括可溶性多糖，例如果膠、瓜爾豆膠以及β-葡聚糖等。黏性纖維可調(diào)控血液中葡萄糖、膽固醇濃度，延長(zhǎng)胃排空時(shí)間，減慢食糜在在小腸的通過(guò)速度。

2 DF對(duì)腸道微生物的影響

DF是寄居在宿主后腸中的密集厭氧微生物的主要能量來(lái)源，微生物發(fā)酵生成的短鏈脂肪酸可為宿主提供能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，否則這些將不能被宿主利用。腸道基因組學(xué)[22]研究表明，腸道微生物可編碼成千上萬(wàn)的碳水化合物酶類(lèi)（Carbohydrate-Active Enzymes，CAZymes）降解糖復(fù)合物、多糖以及寡糖生成可發(fā)酵的單糖：其中微生物的纖維素酶、β甘露聚糖酶、木葡聚糖酶主要分布于 GH5、GH6，GH9、GH12、GH44、GH45、GH48和GH74基因(糖苷鍵水解酶，Glycoside Hydrolase，GH)家族；木聚糖酶主要分布于GH10和GH11基因家族；果膠酶則主要分布于GH28、GH88、GH105、PL1、PL2、PL3、PL4、PL9、PL10、PL11和PL15家族（Polysaccharide Lyase，PL，多糖裂解酶家族）。雖然DF不能被宿主內(nèi)源消化酶降解，但腸道中寄居的不同微生物可編碼不同的CAZ酶從而分解利用不同的碳水化合物（分解不同的糖苷鍵）[23]。例如，纖維素是葡萄糖以β-1,4-糖苷鍵連接形成的，而擁有GH1、GH3、GH5、GH7、GH8、GH9、GH44、GH48、GH51的微生物就可以將纖維素分解利用。DF的添加可以促使富含分解該類(lèi)DF的CAZy酶的微生物增殖，進(jìn)而成為微生物群落中的優(yōu)勢(shì)菌群，而那些缺乏CAZy酶的微生物則很有可能會(huì)淘汰消失。日糧中DF的添加不僅可促進(jìn)含有該纖維的糖苷鍵水解酶的主要降解微生物的生長(zhǎng)，還可以通過(guò)“互養(yǎng)模式”促進(jìn)其他可利用纖維主要降解微生物分解的二級(jí)產(chǎn)物的微生物增殖，從而達(dá)到調(diào)控腸道菌群的作用[24]。

在豬日糧中添加DF可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)化腸道菌群的作用已經(jīng)得到大量研究證實(shí)。日糧中添加34%的抗性淀粉增加了公豬結(jié)腸前端產(chǎn)丁酸菌，如普拉梭菌和埃氏巨型球菌的豐度，降低了潛在致病微生物，如鉤端螺旋體屬微生物的豐度（P＜0.05）[25]。促進(jìn)了結(jié)腸上皮細(xì)胞三羧酸循環(huán)及脂肪酸β-氧化的進(jìn)程。母豬飼糧中添加34%的抗性淀粉能夠增加結(jié)腸產(chǎn)丁酸菌柔嫩梭菌、布氏瘤胃球菌豐度，降低可能致病菌大腸桿菌和假單胞菌屬豐度，同時(shí)增加結(jié)腸短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸濃度[26]。仔豬日糧中添加3.0 g/kg纖維寡糖可以提高腸道緊密連接蛋白Claudin-1和Zonula Occludens-1(ZO-1)的表達(dá)，調(diào)高雙歧桿菌Bifidobacte?rium、乳酸菌Lactobacilli的豐度；降低致病菌如豬鏈球菌Streptococcus suis、大腸桿菌Escherichia coli的豐度，促進(jìn)仔豬腸道健康發(fā)育[27]?？剐缘矸埏@著提高了豬腸道中有益菌：糞腸球菌Coprococcus、瘤胃球菌Ruminococcus，和Turicibacter的豐度，并且糞腸球菌屬與瘤胃球菌屬與食糜中6-磷酸葡萄糖、麥芽糖、花生四烯酸，9,12十八碳二烯酸、油酸濃度存在正相關(guān)。說(shuō)明抗性淀粉不但影響豬腸道菌群，也會(huì)影響菌群代謝及其終產(chǎn)物[28]。而仔豬日糧中添加苜?？梢蕴岣呤耗c球菌Coprococcus eutactus的豐度；降低致病菌如豬鏈球菌Streptococcus suis的豐度，優(yōu)化仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)[29]。

過(guò)往的研究多集中于DF對(duì)腸腔內(nèi)容物中微生物區(qū)系的影響，對(duì)腸黏膜微生物區(qū)系變化的關(guān)注很少。而由于黏膜微生物定植在黏膜層表面，更接近腸道上皮/免疫細(xì)胞，并且區(qū)系結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，可以持續(xù)脫落入腸腔對(duì)腸腔微生物起到“接種作用”，其對(duì)宿主腸道免疫功能的調(diào)節(jié)作用可能更為直接、重要。豬不同腸道部位菌群分布存在異質(zhì)性，相應(yīng)的功能也存在差異，了解不同位置菌群對(duì)營(yíng)養(yǎng)干預(yù)的相應(yīng)變化有利于制定適宜的策略調(diào)節(jié)腸道菌群，促進(jìn)腸道健康[30]。在此基礎(chǔ)上，本課題組發(fā)現(xiàn)同一腸道部位中腸腔與腸黏膜上菌群分布與功能也存在差異，SparCC共線性網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)普雷沃式菌科、毛螺菌科以及韋榮氏球菌科在腸腔和腸黏膜微生物上都形成共現(xiàn)性微生物菌群，而來(lái)自于γ-變形菌門(mén)中機(jī)會(huì)性致病菌則僅在豬腸道黏膜上形成共現(xiàn)性微生物菌群，豬腸道菌群空間分布的異質(zhì)性以及共生模式是與其所在“生態(tài)位”的微環(huán)境緊密相關(guān)[31]。添加果膠、菊粉和微晶纖維素三種DF對(duì)仔豬微生物區(qū)系組成及功能的影響存在腸段之間、腸腔與黏膜之間的差異。三種DF均顯著降低了回腸黏膜菌群的定植（特別是一些病原菌的豐度），降低了回腸黏膜菌群群落的α多樣性，保護(hù)了仔豬黏膜屏障。而DF對(duì)回腸腸腔微生物的改變有限。不同DF對(duì)后腸的核心菌群存在特異性?xún)?yōu)化作用，其中菊粉促進(jìn)了豬后腸腸黏膜上雙歧桿菌的增加而果膠則顯著促進(jìn)了后腸腸黏膜中普雷沃式菌科的增加，具有優(yōu)化腸道菌群的作用。（未發(fā)表數(shù)據(jù)）

3 DF對(duì)黏膜屏障的調(diào)節(jié)作用

3.1 黏膜屏障

腸道黏膜屏障是由微生物屏障、黏液層屏障、機(jī)械屏障、免疫屏障共同構(gòu)成（見(jiàn)表1）。四者不是相互孤立，這些屏障相互作用和支持，共同維護(hù)著腸道的健康。腸道微生物是協(xié)調(diào)這四個(gè)屏障功能的重要載體。仔豬腸道發(fā)育不完全，微生物區(qū)系薄弱，斷奶打破腸道內(nèi)環(huán)境平衡，對(duì)腸道各個(gè)屏障均有顯著地影響。因此，恢復(fù)仔豬腸道內(nèi)環(huán)境平衡，加強(qiáng)腸道微生物區(qū)系緩沖，調(diào)節(jié)和保護(hù)功能，是解決仔豬腹瀉的關(guān)鍵所在。

表1 黏膜屏障的基本組成

3.2 DF對(duì)黏膜屏障的調(diào)節(jié)作用

腸道細(xì)菌擁有降解黏蛋白必需的唾液酸酶和糖硫酸酯酶，但是糖硫酸酯酶的最佳pH值（pH值5.0）要遠(yuǎn)低于唾液酸酶的最適pH值（pH值7.8）。因此，小腸液中性的pH值將導(dǎo)致微生物對(duì)硫酸化黏蛋白的降解程度可能要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)唾液酸化黏蛋白的降解。黏性（膨脹）纖維的攝入主要增加大鼠小腸中唾液酸化黏蛋白（相比于硫酸化黏蛋白）的含量。腸道中硫酸化黏蛋白的降低可能會(huì)導(dǎo)致黏蛋白降解速度的提高，使得微生物更易通過(guò)黏液屏障與腸道上皮細(xì)胞直接接觸。

H.Ito等在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，高黏度的可溶性纖維會(huì)增加腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量，而低黏度纖維的作用不顯著。可溶性纖維會(huì)增加黏液的基礎(chǔ)性分泌，但果膠并不改變杯狀細(xì)胞數(shù)量[35]。S.Hino等研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是給大鼠飼喂可溶性DF（魔芋、車(chē)前草或者瓜爾豆膠，50 g/kg）還是不可溶性纖維（聚苯乙烯、麩皮或者玉米皮，80 g/kg）都能增加回腸杯狀細(xì)胞數(shù)量[36]。此外，對(duì)人的研究表明飲食中缺乏纖維會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸黏液層變薄[37]，減弱黏液屏障。DF對(duì)杯狀細(xì)胞或者黏液層的作用可以通過(guò)直接和間接的作用實(shí)現(xiàn)，直接的作用被報(bào)道與纖維的理化性質(zhì)（黏性以及溶脹性）有關(guān)，而間接的作用則與腸道菌群的調(diào)控有關(guān)。

不同纖維來(lái)源對(duì)于仔豬腸道的上皮細(xì)胞屏障影響并不一致[38]。仔豬日糧中添加10%的小麥麩纖維可顯著上調(diào)腸道黏膜的緊密連接蛋白（ZO1以及OCLN）基因的表達(dá)(P＜0.05)，而飼糧中添加10%的玉米纖維以及大豆纖維卻對(duì)緊密連接蛋白無(wú)顯著影響[39]。此外，體內(nèi)、外的研究均表明DF的發(fā)酵產(chǎn)物短鏈脂肪酸可以促使腸道上皮細(xì)胞增殖。另一方面乳酸桿菌能顯著上調(diào)Caco-2細(xì)胞的緊密連接蛋白OCLN和Claudin基因的表達(dá)，而大腸桿菌與腸道上皮細(xì)胞接觸則導(dǎo)致緊密連接蛋白（ZO-1和Occludin）降解，腸道通透性增加進(jìn)而引發(fā)腸道屏障功能的紊亂。

高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠中，DF可重塑腸道菌群，并促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖及抗菌基因的表達(dá)，而菊粉的益生作用又依賴(lài)于腸道菌群；DF可以通過(guò)恢復(fù)受損的腸道黏液層，防治受到高糖脂低纖維的西方飲食影響的小鼠腸道；抗生素處理或無(wú)菌小鼠中菊粉的保護(hù)作用降低[40]。長(zhǎng)期或間接性DF不足的情況下，腸道菌群訴諸宿主分泌的黏膜糖蛋白作為營(yíng)養(yǎng)源，導(dǎo)致黏膜屏障被侵蝕，更多致病菌侵入黏膜，機(jī)體炎癥反應(yīng)加重。即使后續(xù)日糧中添加包含14種多糖（菊粉、阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖等）的DF也并不能治愈或減輕這樣的結(jié)腸炎癥[37]。

用菊粉預(yù)飼小鼠，可以降低Citrobacter rodentium感染后腸道的炎癥反應(yīng)以及Smad7的表達(dá)，可通過(guò)影響NF-κB和Smad 7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)宿主保護(hù)性免疫反應(yīng)[41]。J.Kovacs-Nolan等研究發(fā)現(xiàn)，β-1，4-甘露二糖（MNB）可以通過(guò)TLR2/4信號(hào)通路激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)小鼠回腸Th1和Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)，提高糞IgA和脾臟NK細(xì)胞活性。LPS刺激后，MNB降低了TNF-α、IL-6、iNOS和IL-10的含量，增加NK細(xì)胞活性，提示MNB可以調(diào)控腸道和系統(tǒng)免疫反應(yīng)，防止LPS誘導(dǎo)的免疫抑制[42]。R.Badia等研究發(fā)現(xiàn)，從Ya?con根中分離的果寡糖可提高腸道先天性免疫功能，增加sIgA的分泌，提高IL-6、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白MIP1a以及TLR4受體的表達(dá)[43]。L.Che等研究發(fā)現(xiàn)，飼喂甜豆纖維影響了腸道屏障、免疫以及代謝相關(guān)的蛋白和基因表達(dá)，顯著改善了仔豬大腸的免疫功能[44]。給仔豬飼喂4%可發(fā)酵的糊精纖維可激活Th2相關(guān)的免疫通路，選擇性下調(diào)促炎因子，減輕三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀[45]。

3.3 DF的直接調(diào)節(jié)作用

最近有研究表明，腸道上皮細(xì)胞可以產(chǎn)生直接的、非益生的作用，但到目前為止僅有少量研究關(guān)注到這個(gè)問(wèn)題[46-49]。目前已有若干實(shí)驗(yàn)室利用人源多個(gè)不同腸道上皮細(xì)胞系證實(shí)了DF可直接調(diào)控腸道免疫反應(yīng)。M.Ortega-Gonzalez等的研究結(jié)果證實(shí)，菊粉以及果寡糖、低聚半乳糖、羊奶寡糖可作為T(mén)LR4的配體直接作用于腸上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)大鼠IEC18腸上皮細(xì)胞系的生長(zhǎng)相關(guān)癌基因（GROα）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）以及MIP2的表達(dá)，其誘導(dǎo)效率可達(dá)LPS的50%～80%。這些DF的免疫調(diào)控作用依賴(lài)于IκB-α磷酸化，Myd88或TLR基因敲除顯著地降低反應(yīng)[50]。M.Zenhom等用寡糖、α3-唾液乳糖、果聚糖直接處理Caco-2細(xì)胞時(shí)，激活了肽聚糖識(shí)別蛋白3（PGlyRP3）以及PPARγ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，下調(diào)IL-12的分泌、TNF-α、IL-8的基因表達(dá)，NF-κB核轉(zhuǎn)位減少[51]。以Caco-2細(xì)胞為模型，Bermudez-Brito等發(fā)現(xiàn)，菊粉、果膠、果寡糖、阿拉伯木聚糖直接激活樹(shù)突狀細(xì)胞的能力并不強(qiáng)，上皮細(xì)胞在介導(dǎo)DF的免疫調(diào)節(jié)有著十分重要的作用[47]。Caco-2上皮細(xì)胞培養(yǎng)液可以直接刺激樹(shù)突狀細(xì)胞生產(chǎn) IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、MCP-1和MIP-1α，DF可以通過(guò)TLR-Myd88信號(hào)通路引起Th1細(xì)胞因子的變化，從而顯著抑制了上皮細(xì)胞的免疫刺激作用。DF可以直接作用于腸道，并不依賴(lài)于共生菌的增殖。這類(lèi)碳水化合物能夠與致病菌結(jié)合，阻止其與黏蛋白糖鏈的黏附；還可以直接上調(diào)IL-10和INF-γ細(xì)胞因子，影響回腸和盲腸的IgA反應(yīng)[43]。

本課題組利用豬空腸上皮細(xì)胞IPEC-J2細(xì)胞系作為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)DF對(duì)腸道上皮細(xì)胞的直接免疫作用進(jìn)行了相關(guān)研究。采用Multiplex Map Kit與Lu?minex液相懸浮芯片測(cè)定IPEC-J2細(xì)胞上清液中13種細(xì)胞因子的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菊粉較對(duì)照組在24 h時(shí)同時(shí)顯著增加了IPEC-J2中促炎因子（IL18、IL6、IL2、GM-CSF）的分泌以及抗炎因子IL10的分泌，而果膠顯著增加了IL18、IL8的分泌，其中菊粉孵育24 h可顯著上調(diào)TLR4的表達(dá)量，暗示菊粉可能通過(guò)激活TLR4模式識(shí)別受體調(diào)節(jié)腸道免疫因子的分泌。菊粉和果膠對(duì)腸道上皮細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)模式不同。而菊粉和果膠在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)腸道免疫因子的影響并不一致。菊粉對(duì)同時(shí)大幅提高IPEC-J2促炎以及抗炎因子的分泌但并未引起動(dòng)物腸道炎癥的過(guò)度炎癥，暗示DF對(duì)腸道上皮細(xì)胞的影響時(shí)需要充分考慮黏液層、腸道上皮細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞以及T細(xì)胞等之間的互作（張莉，未發(fā)表數(shù)據(jù)）。

4 “DF-腸道菌群-黏膜屏障”生理軸

圖2 腸道菌群及其代謝產(chǎn)物影響宿主免疫的主要途徑[52]

黏膜層作為分割腸淋巴層與腸道菌群的動(dòng)態(tài)屏障，通過(guò)黏液層、上皮細(xì)胞與緊密連接蛋白的協(xié)同合作，共同抵御腸道有害菌對(duì)腸道的侵蝕[53]。而黏膜免疫主要包括先天性免疫和獲得性免疫兩部分，其中先天性免疫由物理屏障、先天免疫細(xì)胞與分子構(gòu)成，在腸內(nèi)，這些細(xì)菌通過(guò)模式識(shí)別受體（Pattern Recogni?tion Receptor,PRR）受嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性控制，以識(shí)別和響應(yīng)微生物的異常變化[7]。PRR識(shí)別微生物相關(guān)分子模式（MAMP），主要包括肽聚糖、鞭毛蛋白、脂多糖（LPS）和微生物的核酸結(jié)構(gòu)。PRRs由Toll樣受體（Toll-Like receptors，TLRs），核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（Nucleotide binding Oligomerization Domain，NOD）樣受體（NLRs），視黃酸可誘導(dǎo)基因1（Retinoic Acidinducible Gene，RIG-1）樣受體（RLRs），C型凝集素受體（C-type Lectins Receptor，CLR）等。而獲得性免疫主要是由T細(xì)胞和B細(xì)胞構(gòu)成，病源微生物侵入后一段時(shí)間，T細(xì)胞和B細(xì)胞或者其他免疫細(xì)胞會(huì)分泌細(xì)胞因子、抗菌肽、sIgA等物質(zhì)與先天性免疫系統(tǒng)協(xié)同應(yīng)對(duì)[7，54]。

先天性免疫是由微生物與不同模式識(shí)別受體結(jié)合，激活下游免疫反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。Toll樣受體（TL2、TL4、TL5）與 NOD 受體（NOD1、NOD2、NLRC4、NL?PR3）為微生物與黏膜屏障結(jié)合的主要受體[55]。而Th1、Th2、Th17，Treg和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞是獲得性免疫中主要的效應(yīng)T細(xì)胞，Th17細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，如IL-17、IL-21，以增強(qiáng)炎癥。Treg細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子IL-10以減輕炎癥。Th17和Treg細(xì)胞分化之間的動(dòng)態(tài)平衡由細(xì)胞因子如IL-6、IL-21和IL-2所調(diào)節(jié)[55]。巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和先天淋巴細(xì)胞（ILC）可以感受抗原，然后分泌細(xì)胞因子或趨化因子來(lái)調(diào)節(jié)炎癥響應(yīng)。ILC3充當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞（APC）能夠以主要組織相容性復(fù)合體（MHC）II依賴(lài)性方式獨(dú)特地抑制CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，并能夠分泌IL-22參與修復(fù)受損的上皮細(xì)胞。ILC2可以產(chǎn)生IL-5和IL-13以發(fā)揮上皮衍生的IL-25和IL-33的作用抗蠕蟲(chóng)。T輔助3型（Th3）細(xì)胞、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Breg）和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（IEL）具有通過(guò)IL-10抑制過(guò)量的Th1和Th17應(yīng)答的能力和TGF-β產(chǎn)生。這些免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞通過(guò)相互作用共同維持腸內(nèi)黏膜穩(wěn)態(tài)[56]。

微生物影響?zhàn)つて琳系淖饔脵C(jī)制主要由以下幾條：①直接接觸（direct physical contact）；②產(chǎn)生的代謝物（短鏈脂肪酸、膽汁酸、TMA、吲哚類(lèi)物質(zhì)）（pro?duction of metabolites）；③自身脫落的結(jié)構(gòu)類(lèi)物質(zhì)，如鞭毛（shedding of structural components）[57]。而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)腸道微生物生成代謝產(chǎn)物，進(jìn)而調(diào)節(jié)黏膜屏障上免疫信號(hào)。代謝產(chǎn)物的作用既可以直接作用于免疫細(xì)胞，也可以作用于腸上皮細(xì)胞，進(jìn)而影響下游相關(guān)信號(hào)通路[52]。而DF不僅能調(diào)節(jié)腸道菌群組成和功能，還能調(diào)節(jié)微生物代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（SCFAs）或者轉(zhuǎn)化某些宿主代謝物質(zhì)例如膽汁酸組成等[58]，不僅改善腸道健康，還能影響機(jī)體代謝、動(dòng)物行為[59]。

DF發(fā)酵的主要產(chǎn)物是短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acids，SCFAs），包括乙酸、丙酸、丁酸以及琥珀酸鹽等。SCFAs的生成會(huì)導(dǎo)致腸腔中pH值的降低，既可以抑制病原微生物的生長(zhǎng)也可以促進(jìn)一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。乙酸還在雙歧桿菌抑制病原菌過(guò)程中發(fā)揮重要作用[60]。丁酸可為腸道上皮細(xì)胞供能；增加腸道中黏蛋白的生成繼而改變黏液層中黏附的微生物[61]；還可改善緊密連接的完整[62]。因而，SCFAs的生成在維持腸道屏障功能方面發(fā)揮著重要作用。95%～99%的SCFAs可被機(jī)體迅速吸收并通過(guò)不同的生物合成途徑被宿主利用[63]。通常，乙酸會(huì)轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟并作為肌肉組織的能量底物；丙酸則在肝臟轉(zhuǎn)化為葡萄糖；丁酸則主要被結(jié)腸上皮細(xì)胞利用作為其代謝活動(dòng)的重要來(lái)源[64]。Chen等發(fā)現(xiàn)在Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加SCFAs可有效的促進(jìn)上皮細(xì)胞的保護(hù)與修復(fù)功能[65]。SCFAs在大腸還可以刺激水和鈉離子的重吸收從而限制腹瀉的產(chǎn)生。SCFAs主要通過(guò)以下途徑參與腸道免疫調(diào)節(jié)：①可抑制組蛋白去乙?；福℉DAC）的活性，抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的基因表達(dá)，下調(diào)促炎因子的產(chǎn)生從而抑制腸道炎癥。②通過(guò)短鏈脂肪酸受體-G蛋白耦聯(lián)受體GPR41、GPR43以及GPR109A等發(fā)揮作用，刺激細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，上調(diào)Toll樣受體的表達(dá)[66]。SCFAs與其受體GPR和HDAC相結(jié)合，并引起調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與樹(shù)突細(xì)胞增殖，或分泌IL-18增強(qiáng)黏膜屏障對(duì)有害微生物的抵御性。宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別并消除病原微生物通過(guò)激活效應(yīng)T細(xì)胞功能，這一過(guò)程也受SCFA介導(dǎo)的HDAC抑制和mTORC1活化調(diào)節(jié)。例如，丁酸和丙酸可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的分化，幫助控制腸道炎癥，這些作用是通過(guò)抑制組蛋白的去乙酰化完成[66-67]。腸道炎癥的控制可以幫助維持腸道屏障，從而降低炎癥性腸病（IBD）或者結(jié)直腸癌（CRC）發(fā)生的可能性。除了腸道中主要SCFAs的乙酸、丙酸以及丁酸以外，我們對(duì)其他的SCFAs的潛在益處尚不清楚。近來(lái)的研究表明，高纖維日糧可以增加SCFAs誘導(dǎo)激活GPR43以及GPR109A，從而激活對(duì)于腸道穩(wěn)態(tài)很關(guān)鍵的NL?RP3炎癥體。

腸道微生物不僅可以代謝日糧成分（DF），而且能夠轉(zhuǎn)化宿主分泌代謝的膽汁酸調(diào)控腸道健康。膽汁酸一直被認(rèn)為對(duì)細(xì)胞的先天性免疫可發(fā)揮直接的調(diào)控作用。膽汁酸可降低單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞以及肝臟巨噬細(xì)胞的促炎性因子[68-69]。這一作用主要是由兩種不同的宿主受體介導(dǎo)的：膽汁酸受體（Farnesoid X Receptors FXR）和G蛋白耦聯(lián)膽汁酸受體1（TGR5，膽汁酸的膜型受體）。兩種受體都可以類(lèi)似的方式被初級(jí)膽汁酸和次級(jí)膽汁酸激活。FXR，是一種核配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，可與視黃酸受體RXR形成異二聚體。合成的FXR激動(dòng)劑對(duì)于小鼠模型的結(jié)腸炎具有保護(hù)作用，然而對(duì)FXR基因缺乏（FXR-/-）的小鼠則呈現(xiàn)出更嚴(yán)重的病理。FXR-/-的小鼠也表現(xiàn)出持續(xù)性的肝炎以及肝臟腫瘤[70-71]。TGR5（G蛋白耦聯(lián)的受體），與膽汁酸結(jié)合會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的提高以及ERK的激活[72]。與FXR類(lèi)似，采用合成的激動(dòng)劑激活巨噬細(xì)胞以及Kupffer細(xì)胞的TGR5受體，可以通過(guò)干擾依賴(lài)NF-kβ的轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制LPS誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。這與直接抑制NF-kB的激活相關(guān)[73-75]。初級(jí)膽汁酸和次級(jí)膽汁酸都能夠激活FXR以及TGR，目前尚且不清數(shù)初級(jí)膽汁酸和次級(jí)膽汁酸之間平衡的偏移會(huì)有什么功能性的改變。初級(jí)膽汁酸CDCA是法尼基衍生物X受體FXR的配體可抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的IL-1β、IL-6以及TNF-α的釋放。膽汁酸的腸肝循環(huán)這一生理過(guò)程受到肝臟中復(fù)雜的膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以及腸道中核受體的調(diào)節(jié)，一方面有毒的膽汁酸會(huì)導(dǎo)致炎癥、凋亡以及細(xì)胞死亡。另一方面，膽汁酸激活的核受體以及GPCR信號(hào)會(huì)保護(hù)肝臟、腸道以及巨噬細(xì)胞免受炎癥。已有研究表明DF可以影響膽汁酸池的組成，一方面膽汁酸可以通過(guò)腸道受體直接調(diào)控腸道先天性免疫，另一方面膽汁酸組成的改變也會(huì)對(duì)腸道微生物組成產(chǎn)生影響從而對(duì)腸道免疫起到調(diào)節(jié)作用。

5 小結(jié)及展望

DF對(duì)黏膜免疫的直接影響時(shí)需要充分考慮黏液層、腸道上皮細(xì)胞與其它免疫細(xì)胞（例如樹(shù)突細(xì)胞）之間的互作，以后的試驗(yàn)中可建立腸道上皮細(xì)胞與免疫相關(guān)細(xì)胞的共培養(yǎng)模型來(lái)探究DF的直接免疫作用會(huì)有更深入直觀的理解。

腸道菌群的動(dòng)態(tài)變化符合“安娜·卡列尼娜原則”，健康/平衡狀態(tài)都很相似，而疾病/失衡各有各的不同[76]。如何通過(guò)特定微生物或代謝產(chǎn)物判斷豬腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，并利用特定DF實(shí)現(xiàn)靶向性調(diào)控，需要前期大量的試驗(yàn)積累工作建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，才能將其更好的應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。并且DF對(duì)豬腸道微生物的影響還主要集中在特定菌群豐度的改變，其與黏膜屏障功能變化之間的關(guān)系仍只停留在相關(guān)性的研究水平，缺乏具體機(jī)理與相關(guān)分子機(jī)制的研究。如何通過(guò)定向微生物培養(yǎng)技術(shù)、無(wú)菌動(dòng)物等方法手段，實(shí)現(xiàn)從一個(gè)C（Correlation）到另一個(gè)C（Cau?sality）的跨越，可能是下一步工作的重點(diǎn)。

圖3 日糧纖維通過(guò)SCFA影響宿主免疫反應(yīng)[7]