經(jīng)頭孢他啶誘導(dǎo)產(chǎn)生亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌的耐藥表型及其耐藥機(jī)制研究

蔣逸 ，沈佳麗 ，蔣文玥 ，史偉峰

（1.蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院，江蘇 常州 213003；2.常州市武進(jìn)人民醫(yī)院，江蘇 常州 213161）

0 引言

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的常見病原菌之一，也是免疫功能低下、嚴(yán)重創(chuàng)傷、長期住院患者合并感染的常見病原菌，可引起呼吸科、燒傷科、重癥監(jiān)護(hù)病房等病區(qū)的暴發(fā)流行[1]。對于銅綠假x單胞菌的感染，臨床常規(guī)選擇三代頭孢菌素作為經(jīng)驗(yàn)用藥，但在治療過程中極易出現(xiàn)耐藥，增加臨床治療難度。因此研究頭孢他啶誘導(dǎo)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）產(chǎn)生亞胺培南（Imipenem,IMP）耐藥的機(jī)制具有十分重要的臨床意義。本研究以抗菌藥物全敏的PA臨床分離株為初始菌株，人工誘導(dǎo)使其產(chǎn)生IMP耐藥性，檢測誘導(dǎo)耐藥株碳青霉烯酶、ESBLs、AmpC酶、整合酶、膜孔蛋白o(hù)prD2及主動外排系統(tǒng)等耐藥表型的變化，旨在為進(jìn)一步研究其耐藥的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為臨床合理用藥，有效治療PA感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

20株銅綠假單胞菌敏感菌株均收集自我院2016年7月-12月住院病人標(biāo)本，標(biāo)本種類包括痰、血、分泌物、中段尿、咽拭子等，初篩藥敏實(shí)驗(yàn)由Vitek2Compact及BD Phonenix100全自動細(xì)菌鑒定儀完成，受試菌株對常規(guī)監(jiān)測的11種抗菌藥物均為敏感，包括阿米卡星（AMK）、環(huán)丙沙星（CIP）、左旋氧氟沙星（LEV）、氨曲南（ATM）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢吡肟（FEP）、亞胺培南（IPM）、美洛培南（MEM）、哌拉西林（PIP）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP）、慶大霉素（GEN）。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)為CLSI2017版。

1.2 主要試劑耗材

頭孢他啶藥敏紙片，亞胺培南紙片（10ug/L）均購自O(shè)xoid公司，頭孢他啶藥敏粉劑購自海南海靈化學(xué)制藥有限公司。細(xì)菌DNA提取試劑盒；細(xì)菌總RNA快速抽提試劑盒；M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒；PCR上下游引物；DNA Marker 100bp；瓊脂糖；澳化乙錠（EB）；異丙醇：均購自上海生工生物工程公司。PCR檢測試劑盒：TAKARA公司。SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）：TaKaRa公司。

1.3 主要儀器和儀器

全自動藥敏分析儀Vitek 2 Compact及BD Phonenix100。-70℃低溫冰箱：Thermo公司。二氧化碳培養(yǎng)箱：日本SANYO公司。PCR儀器：Thermo公司。熒光定量PCR儀：MyGoPro。

1.4 方法

1.4.1 全敏PA菌株的篩選

采用全自動藥敏分析儀Vitek2Compact及BD Phonenix100對臨床分離菌株進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，并用Whonet5.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，將鑒定為抗菌藥物全敏的PA分離株，記錄其來源病例信息，挑取各菌株單菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)，用微孔稀釋法測定其最小抑菌濃度（MIC），根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）2017年版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的臨界值判定耐藥、中介和敏感。

1.4.2 多步法誘導(dǎo)耐藥菌株

在12×8孔培養(yǎng)板種加入含相應(yīng)濃度的頭孢他啶-MH肉湯，然后加入受試菌液，使最終的菌液濃度為105CFU/mL，初始誘導(dǎo)濃度為1/4MIC，依次2倍遞增，即1/2MIC、MIC、2MIC、4MIC，每個藥物濃度培養(yǎng)5代，當(dāng)生長不良時可延長培養(yǎng)時間或降低藥物濃度重復(fù)傳代培養(yǎng)，每5代測定頭孢他啶的MIC值，記為 MIC1、MIC2、MIC3、MIC4、MIC5，誘導(dǎo)時間持續(xù)25代，完成誘導(dǎo)后收集菌株，用全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定并觀察耐藥情況。

1.4.3 細(xì)菌處理

將全自動細(xì)菌鑒定儀篩選出來的耐亞胺培南的誘導(dǎo)株，用K-B法進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為美國臨床及實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）2017年標(biāo)準(zhǔn)。儀器法和K-B法亞胺培南均為耐藥者入選。取1mL過夜培養(yǎng)的細(xì)菌菌液，按照細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作程序提取細(xì)菌DNA，作為PCR模板，提取完成后置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 基因檢測

PCR法分別擴(kuò)增銅綠假單胞菌5種金屬β-內(nèi)酰胺酶（MBLs）基因IMP、VIM、SIM、GIM、SPM和7種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）基因TEM、VEB、SHV、PER、OXA-2以 及 OXA-10，2種 AmpC酶 基 因 PDC、DHA，3種整合酶基因intIl、intI2和intI3。引物序列與退火溫度見表1。PCR擴(kuò)增體系采用50ul體系，具體如下：TE buffer 5ul，dNTP 4ul,上、下游引物各1ul，Taq酶0.25ul，DNA模板2ul，ddH2O補(bǔ)足體系。PCR擴(kuò)增條件：金屬酶類，94℃預(yù)變性5min，94℃30s，退火30s，72℃延伸60s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸7min。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和整合酶，AmpC酶：擴(kuò)增產(chǎn)物＞500bp，93℃預(yù)變性5min，然后94℃60s，55℃退火60s，72℃延伸60s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5min；PCR產(chǎn)物＜500bp，93℃預(yù)變性5min，然后93℃30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入10ul6×DNA loading buffer，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，120mV電泳30-40min，紫外燈下觀察結(jié)果，出現(xiàn)目的條帶即認(rèn)為陽性，拍照保存。

1.4.5 基因測序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序，應(yīng)用GenBank在線數(shù)據(jù)庫對比工具BLAST進(jìn)行序列比對。

1.4.6 膜孔蛋白和主動外排表型的檢測

取1mL對數(shù)生長期的細(xì)菌，用細(xì)菌總RNA快速抽提試劑盒標(biāo)準(zhǔn)抽提程序提取細(xì)菌RNA作為RT-PCR模板，提取完成后置-70℃?zhèn)溆谩?/p>

反轉(zhuǎn)錄cDNA合成：采用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒對提取的細(xì)菌RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，生成cDNA后置于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA稀釋10倍作為模板，分別以目的基因和內(nèi)參基因（見表2）作為引物進(jìn)行RT-PCR，銅綠假單胞菌ATCC27853作為正常對照，反應(yīng)體系為10ul體系：SYBRGreen染料5ul，上下游引物各1ul，cDNA模板1ul，ddH202ul，反應(yīng)條件如下：95℃ 420s，95℃ 30s,60℃15s，72℃15s，共40各循環(huán)。相對表達(dá)量以2-ΔΔCt法表示，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實(shí)驗(yàn)株-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照株。

表1 PCR引物序列

表2 熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 抗菌藥物全敏的PA篩選及誘導(dǎo)

在本輪試驗(yàn)中，共從臨床送檢標(biāo)本中分離獲得20例抗菌藥物全敏的PA菌株，經(jīng)頭孢他啶連續(xù)誘導(dǎo)傳代培養(yǎng)25代后，10株P(guān)A菌株誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)镮RPA表型。見表3。

表3 誘導(dǎo)前后銅綠假單胞菌對監(jiān)測藥物耐藥率的比較

2.2 產(chǎn)酶基因檢測結(jié)果

產(chǎn) TEM的 IMP耐藥 PA（IRPA）有 7株，占 70%；產(chǎn)PDC的IRPA10株，占100%；產(chǎn)intIl的IRPA10株，占100%。見圖1-3。

圖1 TEM基因PCR電泳圖

圖2 PDC基因PCR電泳圖

圖3 IntI基因PCR電泳圖

TEM基因測序結(jié)果與GenBank上TEM同源性為 100%（登 錄 號：KX871187.1）。PDC基 因 測 序結(jié)果與GenBank上PDC同源性為100%（登錄號：KY066490.1）。Int-1基因測序結(jié)果與GenBank上Int-I同源性為99%（登錄號：KY171972.1）。

2.3 膜孔蛋白與主動外排表型檢測結(jié)果

OprD2的表達(dá)量降低的有8株，占80%，主動外排系統(tǒng)表型陽性IRPA3株，占30%。見表4。

表4 RT-PCR結(jié)果

3 討論

由于臨床治療PA感染的用藥局限性和不合理性，目前，IRPA己成為細(xì)菌耐藥相關(guān)研究的一個重要關(guān)注對象。三代頭孢菌素作為治療PA的經(jīng)驗(yàn)用藥，已在治療過程中出現(xiàn)耐藥，給臨床治療帶來困難。所以我們用三代頭孢菌素體外誘導(dǎo)臨床分離的抗菌藥物全敏PA產(chǎn)生亞胺培南耐藥，研究其耐藥的機(jī)制，從基因水平了解其耐藥的原因，為臨床合理使用抗菌藥物提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

我們通過模擬體內(nèi)抗菌藥物用量不足的環(huán)境，對PA臨床分離株進(jìn)行體外亞抑菌濃度頭孢他啶連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)傳代，在設(shè)定的傳代次數(shù)結(jié)束時，有10株菌呈IPM耐藥表型，從一定程度上警示臨床，初始第三代頭孢菌素用量不足的短暫治療，可能誘發(fā)敏感的PA對其他抗生素也產(chǎn)生耐藥，從而導(dǎo)致患者住院時間延長、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)增重及病死率升高。

銅綠假單胞菌對碳青霉烯類的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，主要認(rèn)為與以下幾點(diǎn)有關(guān)[9,10]：（1）產(chǎn)生碳青霉烯水解酶：包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、頭孢菌素酶（AmpC酶）、金屬β-內(nèi)酰胺酶（MBLs）等；（2）細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的改變：細(xì)菌的外膜中與抗生素結(jié)合通道蛋白的表達(dá)量相對于正常來說表達(dá)減少或不表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)菌表現(xiàn)為對該抗生素耐藥。其中OprD2被認(rèn)為是亞胺培南進(jìn)入銅綠的特異性通道[11]；（3）主動外排系統(tǒng)的過度表達(dá)：銅綠假單胞菌已知有12種抗藥小結(jié)節(jié)分裂區(qū)RND外排泵，其中 MexAB-OprM，MexCD-OprJ，MexEF-OprN，MexXY-OprM最具臨床意義[12]；（4）細(xì)菌生物膜的形成：由細(xì)菌自身，及其產(chǎn)生的外部多糖基質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等共同包裹所組成[13]，其阻止和抑制白細(xì)胞、抗菌藥物等進(jìn)入生物膜中,從而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性；（5）整合子的介導(dǎo)：1989年Strokes等[14]在質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等可移動性遺傳結(jié)構(gòu)上首次發(fā)現(xiàn)了整合子基因盒系統(tǒng)，它能整合多種藥耐藥基因并作為其主要載體使耐藥基因得到表達(dá)，從而使細(xì)菌發(fā)生多重耐藥，并可通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、染色體等可移動DNA元件上在同種菌或不同菌種之間進(jìn)行水平傳播，使細(xì)菌的耐藥性得以廣泛擴(kuò)散。

對經(jīng)誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)獲得的菌株進(jìn)行基因檢測，試驗(yàn)結(jié)果顯示，各誘導(dǎo)耐藥株的TEM陽性率有70%；PDC的陽性率有100%；intIl的陽性率有100%；OprD2的表達(dá)量降低的80%，主動外排系統(tǒng)表型陽率30%。說明經(jīng)頭孢他啶誘導(dǎo)的PA產(chǎn)生IMP耐藥性涉及ESBLs，AmpC酶，整合子的存在，膜孔蛋白的缺失和主動外排系統(tǒng)激活等多種耐藥機(jī)制。IRPA不同產(chǎn)酶表型的陽性率差異可能與各報道的年份、地域差異及各地的抗菌藥物應(yīng)用習(xí)慣有關(guān)。渠巍等[3]對比了貴陽地區(qū)和江蘇蘇南地區(qū)銅綠假單胞菌β-內(nèi)酰胺酶類獲得性耐藥基因和膜孔蛋白OprD2的攜帶情況，貴陽地區(qū)以O(shè)prD2為主，而蘇南地區(qū)則是β-內(nèi)酰胺酶和膜孔蛋白OprD2共同作用的結(jié)果。而有研究發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)基層醫(yī)院與三級醫(yī)院IRPA耐藥機(jī)制則是由外排泵系統(tǒng)和膜孔蛋白OprD2基因缺失共同介導(dǎo)的[15]。明德松等[16]薈萃分析了16個省市的耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌（CRPA）的耐藥基因分布，發(fā)現(xiàn)我國CRPA以O(shè)prD2基因缺陷為主，金屬酶基因VIM、IMP以及絲氨酸酶基因OXA表達(dá)異常為輔，主動外排系統(tǒng)基因也是一個重要因素。因此不排除由環(huán)境壓力不同引起區(qū)域間流行株的遺傳背景存在差異，誘導(dǎo)后結(jié)果隨之出現(xiàn)類似的區(qū)域現(xiàn)象。ESBLs長期以來都是引起PA產(chǎn)生多藥耐藥性的重要酶類，可水解三代頭孢及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類并被克拉維酸所抑制，引起PA對相應(yīng)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。AmpC可水解三代頭孢及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類，能被四代頭孢、碳青霉烯類抑制，這可能也是本實(shí)驗(yàn)中ESBLs和AmpC表型檢出率較高的原因之一。本實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)后的耐藥PA均攜帶整合酶I，說明這種耐藥性可以在細(xì)菌間傳播，導(dǎo)致細(xì)菌迅速發(fā)展成多重耐藥。

PA對第三、四代頭抱菌素耐藥的機(jī)制主要是產(chǎn)生高活性頭孢菌素酶以及外排系統(tǒng)過度表達(dá)，而外膜蛋白OprD2表達(dá)的缺失或減少是導(dǎo)致銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的重要機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)后的耐藥株表現(xiàn)出膜孔蛋白的表達(dá)降低和外排泵的過度表達(dá)，說明兩種機(jī)制一起作用導(dǎo)致PA對亞胺培南的耐藥性。

本研究探討了頭孢他啶誘導(dǎo)全敏PA臨床分離株發(fā)生耐藥的可能機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)ESBLs，AmpC酶，整合子，膜孔蛋白的缺失和主動外排系統(tǒng)激活等多種耐藥機(jī)制均存在，故頭孢他啶可通過使PA產(chǎn)生各種耐藥機(jī)制從而對其他藥物也出現(xiàn)耐藥。臨床需警惕抗菌藥物劑量不足或偏好用藥導(dǎo)致全敏菌株出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象的發(fā)生。后期我們將繼續(xù)對誘導(dǎo)所得IRPA菌株進(jìn)行深入研究，著重研究誘導(dǎo)前后基因表達(dá)量的變化及其調(diào)控基因的變化。從分子耐藥機(jī)制等方面進(jìn)行研究，為指導(dǎo)臨床合理用藥提供參考依據(jù)。