HPLC-Q-TOF/MS法同時(shí)測(cè)定漁用飼料中磺胺類和喹諾酮類藥物殘留

柯慶青，李詩言，貝亦江，周凡，鄭重鶯，王鼎南，丁雪燕，王揚(yáng)

(浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心，浙江 杭州 310023)

近些年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，水產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題逐漸引起人們關(guān)注?；前奉?SAs)和喹諾酮類(QNs)藥物是人畜通用的抗生素類藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、作用迅速等特點(diǎn)，在畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)中常作為飼料添加劑或動(dòng)物疾病治療藥物[1-2]。磺胺和喹諾酮類抗生素具有一定的毒副作用，長(zhǎng)期攝入含有磺胺和喹諾酮類的動(dòng)物源食品，會(huì)導(dǎo)致抗生素在人體內(nèi)殘留蓄積，使人體產(chǎn)生耐藥性并影響人體健康。中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部235號(hào)公告要求，動(dòng)物源性食品中磺胺類獸藥殘留總量不大于100 μg·kg-1，恩諾沙星(恩諾沙星+環(huán)丙沙星)限量為100 μg·kg-1[3]。漁用配合飼料是水產(chǎn)品養(yǎng)殖中重要的投入品之一，其質(zhì)量直接關(guān)系到水產(chǎn)品的品質(zhì)和安全。因此，建立飼料中磺胺類和喹諾酮類藥物的快速檢測(cè)方法對(duì)飼料的安全監(jiān)管具有重要的意義。

磺胺類和喹諾酮類藥物的化學(xué)性質(zhì)相似，比較容易用同一種方法提取，同時(shí)檢測(cè)。目前檢測(cè)磺胺類和喹諾酮類藥物的方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[4-5]、毛細(xì)管電泳法(CE)[6]、液相色譜法(HPLC)[7-9]、液相質(zhì)譜法(LC-MS)[10]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)[11-17]等。其中毛細(xì)管電泳法靈敏度較低、選擇性較差；酶聯(lián)免疫法結(jié)果易出現(xiàn)假陽性，因此只能作為篩選方法；液相色譜法由于只靠保留時(shí)間定性，抗干擾能力較弱；液相質(zhì)譜法雖然方法的靈敏度較高，但難以完全闡明目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)裂解的信息，準(zhǔn)確定性方面有所欠缺。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有定性能力強(qiáng)，選擇性好，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，近年來，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在獸藥殘留分析中得到廣泛應(yīng)用。目前，采用高分辨、全掃描技術(shù)的四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOF)可以對(duì)多組分化合物進(jìn)行精確的分子量測(cè)定，并可以通過與建立的化合物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配檢索，快速、便捷地對(duì)目標(biāo)化合物和未知化合物進(jìn)行篩查和確定，具有靈敏度高、選擇性好、受基體干擾小、定性準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。目前國內(nèi)外基于Q-TOF對(duì)多組分化合物篩查的研究已涉及食品、醫(yī)藥、環(huán)境安全等多個(gè)領(lǐng)域。漁用飼料安全密切影響著水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，目前采用Q-TOF技術(shù)對(duì)漁用飼料中的磺胺類和喹諾酮類多組分藥物殘留的檢測(cè)分析研究相對(duì)較少。為建立一種高效、低干擾的漁用配合飼料中磺胺類和喹諾酮類藥物檢測(cè)方法，本方法采用酸化乙腈-乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)溶液提取體系進(jìn)行提取，利用乙腈沉淀和冷凍離心的方式減少蛋白質(zhì)干擾，采用新一代反相固相萃取吸附劑，在不用平衡活化的情況下有效地去除樣品中的脂肪和磷脂，較以往固相萃取劑具有更簡(jiǎn)單、更快速、更潔凈的優(yōu)勢(shì)[18]。同時(shí)，本研究利用高分辨高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC-Q-TOF/MS)技術(shù)建立了7 min內(nèi)快速篩查和定量檢測(cè)漁用配合飼料中的15種磺胺類和喹諾酮藥物殘留的方法，為飼料中非法藥物添加的監(jiān)控提供更高效、準(zhǔn)確的技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 待測(cè)樣品

飼料樣品均來自2016年浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心水產(chǎn)投入品監(jiān)督抽查任務(wù)，所有樣品避光常溫保存，待檢測(cè)。

1.1.2 試劑

磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺對(duì)甲氧基嘧啶、磺胺間甲氧基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺二甲基噠嗪、磺胺喹惡啉、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星，德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度均大于95%；乙腈(色譜純)，美國TEDIA公司；甲醇(色譜純)，美國TEDIA公司；甲酸(色譜純)，美國ROE Scientific Inc.公司。

1.1.3 儀器

1290-6540液相色譜、四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司；2202S型電子天平，德國賽多利斯有限公司； TDL-5A離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；Centrifuge 5427R高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；N-EVAP112水浴式氮吹濃縮儀，美國 Oranomation Aassociates Inc.公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；Oasis PRiME HLB固相萃取柱、0.22 μm GHP過濾頭，美國 Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

取1.00 g飼料樣品于15 mL帶蓋聚乙烯離心管中，加入10 mL 0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液，渦旋均勻30 s后加入10 mL 0.1%甲酸乙腈，高速振蕩10 min，放入冰箱冷凍20 min后，5 000 r·min-1離心5 min，取一半體積上清液過0.22 μm GHP濾頭后氮吹近干，加入3 mL超純水復(fù)溶后，將提取液加入Oasis PRiME HLB固相萃取柱，保持每秒1滴的流速流出，10%甲醇水溶液淋洗，6 mL甲醇洗脫，收集洗脫液在40 ℃下氮?dú)獯蹈?，?.1%甲酸乙腈∶水為1∶9的流動(dòng)相定容至1 mL，漩渦使其充分溶解后加入1 mL正己烷，快速漩渦1 min， 4 000 r·min-1離心5 min，棄去正己烷層后過0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)測(cè)試。

1.2.2 色質(zhì)譜條件

以0.1%甲酸溶液(流動(dòng)相A)和甲醇(流動(dòng)相B)溶液為色譜流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。色譜柱為Aglient Plus C18(3.0 nm×100 nm，1.8 μm)，流速為250 μL·min-1，柱溫30 ℃。梯度洗脫程序設(shè)定為：0～1 min，5% B；1～5 min，5%～30% B；5～8 min，30%～50% B；8～15 min，50%～98% B；15～18 min，98% B。

離子源為Dual AJS ESI源，掃描方式為正離子全掃描，全掃描范圍：m/z50～1 000，毛細(xì)管電壓4 000 V，鞘氣溫度400 ℃，鞘氣流速12.0 L·min-1，干燥氣流,8.0 L·min-1，干燥氣溫度325 ℃，誘導(dǎo)解離電壓130 V。采集數(shù)據(jù)時(shí)采用參比液(C5H4N4，其離子精確相對(duì)質(zhì)量為121.050873)實(shí)時(shí)進(jìn)行質(zhì)量校準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理方法的選擇與優(yōu)化

2.1.1 提取試劑的選擇

漁用配合飼料主要來源于動(dòng)物源原料(魚粉、蠶蛹等)和植物性原料(豆餅、菜籽餅、谷實(shí)類等)，在檢測(cè)獸藥殘留的過程中主要干擾物有蛋白質(zhì)、脂肪、色素、糖類等，因此選擇合適的前處理方法尤為重要。

配合飼料基質(zhì)較為復(fù)雜，單一試劑提取雜質(zhì)較多，會(huì)給后期的凈化帶來困難，經(jīng)過試驗(yàn)優(yōu)化，本試驗(yàn)采用酸化乙腈-0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液提取體系。在加入有機(jī)溶劑提取前，先用0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液對(duì)樣品進(jìn)行處理。有研究發(fā)現(xiàn)，在加入有機(jī)溶劑前，用水將樣品分散可增加大部分藥物的提取回收率[19]，這可能由于水提前加入均質(zhì)可以將飼料樣品充分分散，增大了有機(jī)溶劑和樣品的接觸面積，有利于水溶性藥物的溶解，同時(shí)螯合劑Na2EDTA的加入可絡(luò)合飼料中存在的大部分金屬離子，可改善喹諾酮類藥物的峰形，提高提取回收率。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯是常見的提取試劑，相較于甲醇和乙酸乙酯，乙腈具有較強(qiáng)的提取效率且具有沉淀蛋白的作用。由于磺胺類和喹諾酮類藥物都具有酸堿兩性性質(zhì)，與純乙腈相比，0.1%甲酸乙腈提取效率更高。本實(shí)驗(yàn)采用酸化乙腈-0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液提取后，提取液放入冰箱冷凍20 min后離心取上清液，加入乙腈，冷凍后使得蛋白沉淀。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了水、乙腈分步提取和乙腈水溶液直接提取方法，發(fā)現(xiàn)用前者提取，上清液更澄清，提取回收率更高。若加入的有機(jī)溶劑比例過低，藥物的回收率偏低，當(dāng)加入的有機(jī)溶劑比例為50%時(shí)，所有化合物的回收率均能較好地滿足分析要求方法。因此，本研究選用10 mL 0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液及10 mL 0.1%甲酸乙腈為提取溶劑。

2.1.2 凈化方法的選擇

目前飼料中藥物殘留檢測(cè)的前處理方法主要有QuECHERS方法和固相萃取法。本研究對(duì)2種方法進(jìn)行了比較和選擇，在使用QuECHERS方法的過程中，由于飼料成分復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)較大，基質(zhì)干擾較為明顯，常用的吸附劑如PSA、GCB等對(duì)部分目標(biāo)藥物有一定的吸附，導(dǎo)致方法的靈敏度較低。

樣品經(jīng)過乙腈沉淀及冷凍離心后已經(jīng)去除了大部分蛋白質(zhì)，但仍可能存在少量的脂肪、色素等雜質(zhì)。本研究采用了新型反相固相萃取Oasis PRiME HLB固相微萃取柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化， 可有效去除脂肪、磷脂、部分色素等雜質(zhì)干擾，且填料具有水可浸潤(rùn)性，無須活化和平衡，在高水相的情況下，填料對(duì)目標(biāo)化合物有較好的保留和較高的載量，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不被保留而與目標(biāo)物分離。用高洗脫強(qiáng)度的有機(jī)試劑將目標(biāo)化合物洗脫收集，而部分動(dòng)物性油脂非極性雜質(zhì)則會(huì)保留在小柱上，有效實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物和雜質(zhì)的分離。且從塔板理論來說，固相微萃取小柱塔理論板數(shù)為幾百，相較于塔板數(shù)為1的QuEchERs的通過策略，固相微萃取凈化效率較高。因此本研究預(yù)處理采用Oasis PRiME HLB固相微萃取柱進(jìn)行富集、凈化。由于乙腈洗脫能力過強(qiáng)，可將色素等雜質(zhì)一起洗脫下來，故選擇甲醇為洗脫液。

2.2 色譜條件優(yōu)化

磺胺類和喹諾酮類藥物均溶于甲醇，選擇甲醇-水體系作為流動(dòng)相，由于磺胺類和喹諾酮類均屬于兩性物質(zhì)，色譜峰較易拖尾，在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸，可以一定程度上改善峰型，并且增強(qiáng)離子化效率，提高檢測(cè)靈敏度。由于不同藥物的極性有所差異，采取梯度洗脫的方式進(jìn)行洗脫，7 min內(nèi)可完成15種藥物的分析(圖1)。

1，磺胺嘧啶；2，磺胺吡啶；3，諾氟沙星；4、氧氟沙星；5，環(huán)丙沙星；6，磺胺二甲基嘧啶；7，丹諾沙星；8， 磺胺對(duì)甲氧基嘧啶；9，恩諾沙星；10， 磺胺間甲氧基嘧啶；11，沙拉沙星；12，磺胺甲噁唑；13，磺胺鄰二甲氧嘧啶；14，磺胺二甲基噠嗪；15，磺胺喹惡啉圖1 15種磺胺和喹諾酮藥物的提取離子流

2.3 數(shù)據(jù)庫的建立

化合物篩查數(shù)據(jù)庫是篩查目標(biāo)獸藥的判定依據(jù)，本研究通過 Agilent Mass Hunter Workstation軟件(Version B 5.00)完成各化合物數(shù)據(jù)的采集與處理，Agilent Mass Hunter PCDL Manager軟件(Version B 4.00)完成化合物篩查數(shù)據(jù)庫的建立。建立化合物篩查數(shù)據(jù)庫時(shí)，在相同流動(dòng)相的情況下，將一定濃度的磺胺類和喹諾酮類的標(biāo)準(zhǔn)溶液以正離子模式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，找出各個(gè)化合物的母離子。進(jìn)一步對(duì)母離子進(jìn)行子離子掃描，得到各個(gè)化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖和特征子離子信息。為了保證篩查數(shù)據(jù)的完整性和可靠性，分別采集了毛細(xì)血管電泳為10、20和40 eV時(shí)各化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖加入譜庫，建立包括化合物精確分子量、保留時(shí)間、特征離子碎片信息的化合物數(shù)據(jù)庫。歐盟 2002/657/EC 決議要求，當(dāng)使用高分辨質(zhì)譜作為確證技術(shù)時(shí)，化合物的確證需要至少4個(gè)鑒別分?jǐn)?shù)，其中檢測(cè)到1個(gè)結(jié)構(gòu)碎片獲得2個(gè)鑒別分?jǐn)?shù)，二級(jí)質(zhì)譜中的每個(gè)子離子獲得2.5個(gè)分?jǐn)?shù)，即1個(gè)具有精確質(zhì)量數(shù)的母離子和 1個(gè)特征碎片子離子即可獲得4.5分的鑒定分?jǐn)?shù)。本研究所建立的HPLC-Q-TOF/MS檢測(cè)方法中，每個(gè)化合物已經(jīng)確證至少1個(gè)精確質(zhì)量數(shù)的母離子和2個(gè)特征子離子，滿足超過4分的鑒定確證分?jǐn)?shù)點(diǎn)的條件。表1列出了15種化合物的精確質(zhì)量分子量、保留時(shí)間和特征離子碎片等信息。利用已建立好的數(shù)據(jù)庫對(duì)樣品進(jìn)行藥物篩查，HPLC-Q-TOF/MS檢測(cè)篩查得分高于70分的獸藥(得分依據(jù)為精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間和同位素豐度)，對(duì)初篩篩查出的獸藥采用建立好的Target-MS/MS方法進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得目標(biāo)獸藥的碎片離子信息，并進(jìn)行二級(jí)離子比對(duì)確證，通過基質(zhì)加標(biāo)的形式，消除基質(zhì)效應(yīng)，并通過外標(biāo)法利用母離子對(duì)篩查出的化合物進(jìn)行定量。

表1 15種目標(biāo)物的保留時(shí)間以及質(zhì)譜參數(shù)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

由于飼料基質(zhì)較為復(fù)雜，基質(zhì)物質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的分析過程有一定干擾。本實(shí)驗(yàn)利用空白飼料樣品的基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析，使標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)際樣品有相同的離子化環(huán)境，以減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)的干擾。在選定的色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)下，以漁用配合飼料空白基質(zhì)溶液配制6種質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)測(cè)試，15種藥物均以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(X，μg·L-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程(表2)。結(jié)果表明，15種待測(cè)物的線性范圍均為10～500 μg·L-1，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.988～0.997，表明各化合物具有良好的線性關(guān)系。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測(cè)定，以離子信噪比(S/N)>3確定樣品的檢出限(LOD)，S/N>10為定量限(LOQ)，得到15種化合物的LOD范圍為3.0～8.0 μg·kg-1，LOQ范圍為10.0～25.0 μg·kg-1。

2.5 回收率和精密度

為了考察檢測(cè)方法的可行性，向空白飼料樣品中添加3個(gè)濃度水平的15種獸藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組做6個(gè)平行，按照上述前處理方法和儀器條件進(jìn)行測(cè)定，回收率和精密度結(jié)果見表3。

表2 15種目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、 檢出限和定量限

表3 飼料中15種目標(biāo)物的平均加標(biāo)回收率和 精密度

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)浙江省投入品監(jiān)督抽查任務(wù)中抽查的80批次漁用飼料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，抽檢的飼料均無上述磺胺類和喹諾酮類藥物添加?？紤]在實(shí)際生產(chǎn)中一般在飼料投喂前進(jìn)行拌藥，而養(yǎng)殖生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)抽取的基本上是未啟封的包裝飼料。在這個(gè)環(huán)節(jié)監(jiān)控上，存在一定風(fēng)險(xiǎn)，所以飼料和漁用飼料的藥物殘留問題仍需連續(xù)監(jiān)測(cè)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用Oasis HLB固相萃取柱凈化方法對(duì)漁用配合飼料進(jìn)行前處理，通過對(duì)前處理方法改進(jìn)，色質(zhì)譜條件優(yōu)化，依據(jù)建立的化合物數(shù)據(jù)庫，建立了漁用配合飼料中9種磺胺類和6種喹諾酮類藥物的HPLC-Q-TOF/MS篩查方法。該方法具有簡(jiǎn)單、靈敏、適用范圍廣等特點(diǎn)，適用于飼料中多種磺胺類和喹諾酮類藥物的快速篩查分析，其靈敏度和準(zhǔn)確度均能滿足獸藥殘留檢測(cè)分析的要求，為飼料的質(zhì)量安全監(jiān)管工作提供有力工具。