脯氨酸羥基化促進芋螺毒素lt3a的氧化折疊?

王磊，曾夏蕓，任政華

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院制藥工程系，廣東 廣州 510642；2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

芋螺毒素是新型海洋藥物的重要資源庫，在芋螺毒素中存在大量、高豐度的翻譯后修飾。芋螺毒素是直接的基因產(chǎn)物，其多種多樣的修飾是由不同的酶系統(tǒng)在基因翻譯后催化生成的。芋螺毒素編碼基因在核糖體中經(jīng)過翻譯后，產(chǎn)生70-120個氨基酸的前體肽，前體肽到成熟肽的過程中發(fā)生了蛋白酶切割、二硫鍵形成等過程，除此之外，還存在很多針對單個氨基酸的翻譯后修飾，如脯氨酸的羥化、谷氨酸的羧化和色氨酸的溴化等，在芋螺毒素中已發(fā)現(xiàn)了10種以上的翻譯后修飾[1-2]。

芋螺毒素翻譯后修飾可使單一基因生成不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的多肽分子，大大增加了芋螺毒素的多樣性，增強了毒素對靶分子的識別能力與專一性，同時也提高了芋螺毒素分子對蛋白酶的抗性，改變了修飾后毒素的物理化學(xué)性質(zhì)[3]。翻譯后修飾在不同的芋螺毒素中的分布很不均一，有些芋螺毒素除了基本的蛋白酶切割和二硫鍵形成外沒有其他修飾，而有些芋螺毒素家族則被高度修飾，如僅13個氨基酸組成的芋螺毒素tx5a，就含有兩個羧化谷氨酸、一個溴化色氨酸、一個羥化脯氨酸和一個糖基化的蘇氨酸，再加上二硫鍵的形成，總共涉及到5種不同的翻譯后修飾體系[4]。

羥化脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)是一種在芋螺毒素中廣泛存在的翻譯后修飾。最早在μ-芋螺毒素GIIIA中發(fā)現(xiàn)含有多個Hyp[5]，隨后在多個超家族芋螺毒素中均發(fā)現(xiàn)含該修飾的殘基，但是羥化脯氨酸在芋螺毒素中起的作用尚不能明確。據(jù)文獻報道，含不同羥脯氨酸殘基的μ-芋螺毒素GIIIA和GIIIB都有生物學(xué)活性，說明Hyp不影響GIIIA和GIIIB生物學(xué)活性[6]；芋螺毒素ε-TxIX序列中的含有的Hyp可能對受體的識別和結(jié)合有所影響[7]。Contryphan家族的Lo959和Am975具有同樣的氨基酸序列，區(qū)別是前者在第3位上是脯氨酸，后者是Hyp，兩者的受體都是高電壓激活的Ca2+通道，但是作用卻完全相反，Lo959能增大Ca2+電流，而Am975具有抑制Ca2+電流的活性，不過這種相反的作用結(jié)果有待進一步驗證[8]。ω-芋螺毒素GVIA 的Hyp10和Hyp21被脯氨酸替換后，對毒素的生物學(xué)活性及對受體N型電壓門控鈣離子通道的作用沒有影響，NMR結(jié)果顯示僅對毒素的三維結(jié)構(gòu)有一定的影響[9]。ω-芋螺毒素MVIIC的序列中脯氨酸突變?yōu)榱u脯氨酸后，會提高多肽體外折疊的效率[10]。上述的研究表明，Hyp對芋螺毒素的體外折疊和活性都有一定的影響，但其在芋螺毒素中存在的生物學(xué)意義及其作用機制還有待進一步的闡明[10]。

我們在前期研究中，從信號芋螺(Conuslitteratus)毒管中分離鑒定得到一個M-超家族芋螺毒素lt3a，經(jīng)過Edman降解和質(zhì)譜分析，推測lt3a含有兩個羧化谷氨酸和一個羥化脯氨酸，進一步的對其cDNA序列進行分析，確定芋螺毒素lt3a的氨基酸序列為DγCCγOQWCDGACDCCS, γ 代表羧基化谷氨酸，O代表羥基化脯氨酸[12-13]。為進一步研究芋螺毒素中脯氨酸羥基化修飾的功能，本研究應(yīng)用化學(xué)合成的方法，制備了未經(jīng)脯氨酸修飾的多肽lt3a和第6位為Hyp的lt3a[P6O]，并進一步的對其氧化折疊效率、熱穩(wěn)定性和生物學(xué)功能進行了研究。該研究為闡明芋螺毒素羥脯氨酸的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

Fmoc保護修飾的氨基酸購自成都凱泰；Fmoc-L-4-Hydroxyproline購自J&K chemical Ltd.；樹脂購自上海吉爾生化；氧化型和還原型谷胱甘肽(GSSG和GSH)購自Amresco公司。CHCA(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)、DTT、碘乙酰胺、碳酸氫銨購自Sigma， ZipTip購自Millipore；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 溶液配制

裂解液試劑R：φ, 三氟乙酸 90%，苯甲硫醚5%，二巰基乙烷3%，苯甲醚2%。

茚三酮指示劑： 2.5 g茚三酮固體溶于50 mL無水乙醇，充分振搖使固體完全溶解，保存在棕色試劑瓶中。

GSSG/GSH氧化溶液：100 mmol Tris-HCl，0.1 mmol EDTA，1 mmol GSSG， 1 mmol GSH，pH7.8。

任氏液：NaCl 6.5 g，KCl 0.14 g，CaCl20.12 g，NaH2PO40.01 g，pH 7.2，定容至1 L。

1.3 主要儀器

Waters公司Delta 600E高效液相色譜儀；C18反相柱為Waters公司Symmetry 300 C18色譜柱, 規(guī)格5 μm, 250 mm×4.6 mm；LABCONCO公司FREEZONE PLUS 12冷凍干燥機；美國Thermo公司LCQ DECA XP高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC/MS)；日本JASCO公司J-810圓二色譜儀；美國Accelry公司insight II分子模擬軟件；成都泰盟科技有限責(zé)任公司BL-420E生物機能系統(tǒng)和神經(jīng)屏蔽盒。

1.4 芋螺毒素lt3a和lt3a[P6O]的固相合成

參照文獻方法進行[14]，稱取0.1 mmol的樹脂，裝入合成柱中，加入2-3 mL的w=20%哌啶/DMF脫去Fmoc保護。分別根據(jù)lt3a和lt3a[P6O]的序列，按C端到N端順序，偶聯(lián)上第一個氨基酸，脫Fmoc保護基團后，活化下一個氨基酸并加入柱中，繼續(xù)去保護、活化，偶聯(lián)，直到偶聯(lián)上最后一個氨基酸，脫Fmoc保護基團后，加入2-3 mL裂解液至肽樹脂，將合成的粗肽裂解下來，并用預(yù)冷的10倍體積乙醚沉淀和洗滌粗肽約5次，凍干備用。

1.5 lt3a和lt3a[P6O]氧化折疊比較

采用GSSG/GSH法進行多肽的氧化折疊，將精確稱量的多肽固體，用小量體積的超純水溶解后，加入到GSSG/GSH氧化溶液中，使終濃度為0.3 mg/mL。在室溫下用磁力攪拌器進行攪拌，在所選時間點取樣加入φ=0.8%的甲酸終止反應(yīng)。并將多肽凍干濃縮體積，將凍干后的多肽用適當體積的φ=0.1%三氟乙酸溶解后直接上Waters公司的Symmetry 300 C18反相柱 (30 nm, 5 μm, 4.6 mm ×250 mm) 進行檢測。線性梯度洗脫，程序如表1所示，同時檢測215 nm和280 nm吸收峰，使用儀器自帶分析軟件進行譜圖處理，根據(jù)保留時間和峰值判斷多肽的氧化折疊情況。

表1 反相高效液相色譜洗脫梯度
Table 1 Gradient of reverse-phase HPLC

時間/min流速/(mL·min-1)A/﹪B/﹪曲線﹡1.0955﹡201.05956

A:φ=0.1%三氟乙酸;B: 乙腈

A:φ=0.1%TFA;B: Acetonitrile

1.6 多肽的質(zhì)譜鑒定

多肽的質(zhì)譜鑒定參照文獻[15]所述方法進行，在中山大學(xué)測試中心的LC/MS上進行，直接將HPLC收集的目標峰取5 μL進樣，在正離子模式下進行質(zhì)譜檢測。

1.7 lt3a和lt3a[P6O]的熱穩(wěn)定性比較

精確稱量純化好的lt3a和lt3a[P6O]，配成終濃度為100 μmol/L的多肽溶液，在空氣浴加熱儀上100 ℃分別加熱0.5、1、2、4和8 h。待冷卻到室溫后進行HPLC分析。

1.8 lt3a和lt3a[P6O]結(jié)構(gòu)分析

lt3a和lt3a[P6O]圓二色光譜分析參照文獻方法進行[16]：使用圓二色譜儀在25 ℃下測定遠紅外190-260 nm的光譜。測定樣品的濃度為100 μmol/L，樣品杯光徑0.1 cm。分辨率0.5 nm，帶寬1 nm，靈敏度50 mdeg，速度50 nm/s，數(shù)據(jù)用Origin6.0進行作圖。

多肽三級結(jié)構(gòu)模擬：使用分子模擬軟件insightII (Accelry, USA)對這兩個多肽進行結(jié)構(gòu)的模擬。通過對lt3a序列的比對，根據(jù)M超家族內(nèi)第3個環(huán)內(nèi)氨基酸的數(shù)目分類方式，lt3a屬于m-1家族。而之前的研究顯示，m-1家族通常是1-5，2-4，3-6的二硫鍵連接方式。所以模擬采用m-1家族的連接方式形成二硫鍵。模擬條件設(shè)定：結(jié)構(gòu)優(yōu)化選擇conjugate收斂方式，設(shè)置R值為0.001，每次計算1 000次。優(yōu)化結(jié)構(gòu)直到能量達到最低，構(gòu)象不再變化為止，模擬出來的結(jié)構(gòu)用pymol 軟件進行顯示。

1.9 lt3a和lt3a[P6O]對神經(jīng)干復(fù)合動作電位的影響比較

按照生理學(xué)實驗的方法制備蛙坐骨神經(jīng)干標本: 蛙(蟾蜍)毀腦脊髓，去上肢和內(nèi)臟，下肢剝皮浸于任氏液中，分離出坐骨神經(jīng)，室溫條件下將制備好的神經(jīng)標本縱向放于神經(jīng)屏蔽盒的電極上，接好刺激電極和記錄電極。神經(jīng)干應(yīng)與每個電極密切接觸。盒內(nèi)注入少量任氏液，蓋上盒蓋，使神經(jīng)盒封閉，防止神經(jīng)干燥。進入BL-420E工作界面，選擇實驗項目-肌肉神經(jīng)實驗-神經(jīng)干興奮傳導(dǎo)速度測定。引導(dǎo)、記錄及觀察蟾蜍坐骨神經(jīng)干的復(fù)合動作電位:待引導(dǎo)出的復(fù)合動作電位較穩(wěn)定后，將一小團加藥棉花貼附在刺激電極和記錄電極中間的神經(jīng)上，間隔不同的時間進行記錄和觀察復(fù)合動作電位的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 lt3a與lt3a[P6O]的固相化學(xué)合成

為了研究羥脯氨酸的功能，首先應(yīng)用固相化學(xué)合成的方法合成了沒有羥基化修飾的多肽lt3a和第6位上為羥脯氨酸的多肽lt3[P6O]，經(jīng)過 RP-HPLC純化后，進行氧化折疊，并對合成的多肽進行質(zhì)譜檢測，結(jié)果如圖1所示，lt3a預(yù)測相對分子質(zhì)量為1 859.5，質(zhì)譜測定結(jié)果為1 859.3，lt3a[P6O]預(yù)測相對分子質(zhì)量為1 875.5，質(zhì)譜測定結(jié)果為1 877(938.5為二價離子峰)，合成的多肽均與預(yù)期相符。

圖1 lt3a和lt3a[P6O]合成多肽的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of synthetic peptides lt3a and lt3a[P6O]

2.2 lt3a與lt3a[P6O]的氧化折疊比較

羥脯氨酸在膠原及某些芋螺毒素中具有促進蛋白或多肽進行正確折疊的功能，本研究試圖通過比較lt3a和lt3a[P6O]氧化折疊的差異，以驗證羥脯氨酸對毒素體外氧化折疊時形成正確構(gòu)象的影響。尚未氧化折疊的lt3a和lt3a[P6O]在氧化/還原型的谷胱甘肽溶液中進行折疊反應(yīng)，分別取不同時間點用甲酸終止后進行反相HPLC檢測。得到的譜圖如圖2所示，通過Empower軟件對目的峰進行積分，計算出各時間點的正確折疊產(chǎn)物的得率，作出時間-得率圖如圖3所示。從圖2和圖3中l(wèi)t3a和lt3a[P6O]的氧化折疊比較發(fā)現(xiàn)，lt3a[P6O]在90 min時就達到了氧化折疊的終點，而lt3a在120 min以后才到了氧化折疊的終點。由表2可知，lt3a[P6O]和lt3a的折疊終產(chǎn)率分別為39.9%和40.6，沒有顯著差異，說明Hyp對氧化的終產(chǎn)率沒有太大的影響，這可能跟lt3a本身就具有較高的氧化折疊效率有關(guān)。但是lt3a[P6O]的氧化折疊速率是lt3a的兩倍。說明Hyp的存在提高了折疊速率，使lt3a[P6O]更早地達到氧化終點。

表2 lt3a和lt3a[P6O]的最終得率和折疊速率Table 2 Folding product and kinetics of lt3a and lt3a[P6O]

圖2 lt3a和lt3a[P6O]不同氧化折疊時間的HPLC分析Fig.2 HPLC analysis of lt3a and lt3a[P6O] in different oxidative folding time

圖3 lt3a和lt3a[P6O]氧化折疊速率比較圖Fig.3 Folding kinetics of conotoxins lt3a and lt3a[P6O]

2.3 lt3a和lt3a[P6O]的結(jié)構(gòu)比較

首先對合成的多肽lt3a和lt3a[P6O]進行圓二色譜的測定，圖4的結(jié)果表明, lt3a和lt3a[P6O]的二級結(jié)構(gòu)主要由β結(jié)構(gòu)組成， 含有部分自由卷曲，沒有α-螺旋結(jié)構(gòu)，兩種多肽的圓二色譜圖極其相似，都在201 nm處有一個特征吸收峰。這說明羥化脯氨酸的存在對lt3a的二級結(jié)構(gòu)沒有顯著的影響。

圖4 lt3a和lt3a[P6O]的圓二色譜圖Fig.4 Far uv of circular dichroism spectra of lt3a and lt3a[P6O]

圖5 lt3a和lt3a[P6O]的分子結(jié)構(gòu)模擬Fig.5 The molecular structure simulation of lt3a and lt3a[P6O]

進一步的應(yīng)用模擬軟件insightII對lt3a和lt3a[P6O]進行三維結(jié)構(gòu)模擬，結(jié)果表明結(jié)果lt3a[P6O]與lt3a的三級結(jié)構(gòu)類似(見圖5)，lt3a[P6O]在C端形成一個大的略扭曲的Loop環(huán)。羥脯氨酸的存在沒有對lt3a整體的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的影響。

2.4 lt3a和lt3a[P6O]的熱穩(wěn)定性比較

合成并純化后的lt3a和lt3a[P6O]在100 ℃的空氣浴中處理不同時間后，用HPLC檢測毒素的降解情況，應(yīng)用Empower軟件對峰面積進行積分后，計算出不同處理時間點的未降解毒素比率，作出時間和未降解毒素的曲線圖，結(jié)果如圖6所示。芋螺毒素lt3a[P6O]的降解速度略快于lt3a，兩者在100 ℃下經(jīng)過8 h的解熱，都發(fā)生了完全的降解。說明Hyp對熱穩(wěn)定性影響不大。

圖6 lt3a和lt3a[P6O]熱穩(wěn)定性比較Fig.6 Comparison of thermal stability between lt3a and lt3a[P6O]

2.5 lt3a和lt3a[P6O]對神經(jīng)干復(fù)合動作電位的作用比較

本實驗分別在兩種濃度下測定了lt3a和lt3a[P6O]對神經(jīng)干復(fù)合動作電位的抑制活性。由圖7的結(jié)果知，在低濃度(0.25 mmol/L)下，lt3a與其羥化脯氨酸異構(gòu)體lt3a[P6O]具有相同的動作電位抑制活性，在高濃度下(2.5 mmol/L)，用藥后前15 min內(nèi)，lt3a起效更快，用藥20 min時，兩者達到相同的抑制活性，該結(jié)果說明Hyp的存在對毒素的活性影響不大。

圖7 lt3a和lt3a[P6O]對神經(jīng)干復(fù)合動作電位的作用Fig.7 The effect of lt3a and lt3a[P6O] on compound action potential of nerve trunk

3 討 論

羥脯氨酸是哺乳動物中常見的一種經(jīng)翻譯后修飾的氨基酸，由脯氨酸經(jīng)脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase)催化生成，一般羥化發(fā)生在4位上。這種氨基酸在哺乳動物的膠原蛋白、補體成分C1q和乙酰膽堿酯酶(AChE)等蛋白中廣泛存在[17]。在非脊椎動物線蟲的微膠原蛋白(minicollagen)[18]以及芋螺的毒素多肽中也有發(fā)現(xiàn)。羥化脯氨酸在膠原蛋白中的功能已經(jīng)得到了闡明[19-21]。研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白中脯氨酸選擇性的羥化是蛋白合成后的分泌以及三級螺旋結(jié)構(gòu)的形成所必需的。在本研究中我們通過合成羥脯氨酸的取代物，驗證了羥脯氨酸能夠幫助芋螺毒素的體外折疊，其原因推測可能是由于脯氨酸肽鍵和羥脯氨酸肽鍵在溶液中具有不同的順反異構(gòu)(cis-trans isomerizaiton)轉(zhuǎn)換率有關(guān)[22]。正常肽鍵反式構(gòu)象的能量比順式構(gòu)象的能量低約2.5×4.184 J/mol，所以自然狀態(tài)下的肽鍵絕大多數(shù)采取的是反式構(gòu)象，順式肽鍵在蛋白中很少見。但是脯氨酸肽鍵的反式構(gòu)象能量僅比順式構(gòu)象低約0.5×4.184 J/mol，且順反異構(gòu)的能量壁壘是13×4.184 J/mol，而正常肽鍵的能量壁壘為20×4.184 J/mol[23]。脯氨酸肽鍵在適當條件下可以克服這個能量壁壘進行構(gòu)象轉(zhuǎn)換。而且羥脯氨酸的存在使多肽的構(gòu)象更快到達平衡狀態(tài)，從而加快了折疊的效率。

雖然脯氨酸的羥化修飾可能會帶來體外折疊效率的提高，但在體內(nèi)是否也有相同的作用以及是否需要用這種修飾來促進毒素折疊還不得而知。不過脯氨基-4-羥化酶(prolyl-4-hydroxylase, P4H)的一個亞基與蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase, PDI)高度同源[18]，有可能在體內(nèi)也會對毒素多肽的折疊產(chǎn)生一定的影響。然而目前還沒有研究表明P4H具有體內(nèi)催化多肽氧化折疊的作用。

對lt3a和lt3a[P6O]熱穩(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn)，羥脯氨酸的存在沒有增加芋螺毒素lt3a的熱穩(wěn)定性，而哺乳動物中膠原蛋白則可以提高其熱穩(wěn)定性，此外，圓二色譜的結(jié)果顯示lt3a和lt3a[P6O]都沒有α螺旋，這可能解釋了羥脯氨酸在芋螺毒素中沒有增加熱穩(wěn)定性的原因，是與lt3a沒有螺旋結(jié)構(gòu)以及足夠多的Hyp有關(guān)。膠原蛋白具有穩(wěn)定的三股螺旋結(jié)構(gòu)，而羥脯氨酸如星羅點綴于其間，羥基伸向螺旋外側(cè)吸引著水分子，與水分子形成“水橋”，氫鍵的形成大大提高了膠原蛋白的熱穩(wěn)定性。芋螺毒素和膠原蛋白的結(jié)構(gòu)完全不同，所以羥脯氨酸在它們之中的作用也大有差異。同時，羥脯氨酸對lt3a的活性似乎也沒有太大的影響，從組織水平上的實驗看來，lt3a和lt3a[P6O]具有相同的抑制動作電位的活性?？赡苁橇u脯氨酸的氫鍵和受體分子沒有相互作用，所以不影響毒素的活性。