高溫液態(tài)水預(yù)處理結(jié)合表面活性劑促進(jìn)纖維素酶水解玉米芯

戴 莉，劉 凱，韓 峰，艾仕云，周 雙

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271018；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271018）

利用現(xiàn)代生物和化學(xué)技術(shù)，開發(fā)和利用可再生的木質(zhì)纖維素，將其轉(zhuǎn)化為燃料和化學(xué)品，可以降低對(duì)不可再生的石油資源的依賴，實(shí)現(xiàn)人類社會(huì)可持續(xù)發(fā)展[1-3]。然而，在與自然界長(zhǎng)期抗?fàn)幍倪^程中，植物形成了復(fù)雜、致密的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素以不同的方式共存于細(xì)胞壁中，相互緊密交織在一起[4，5]，導(dǎo)致直接降解木質(zhì)纖維素難度較大，周期長(zhǎng)，很難進(jìn)行高效的工業(yè)化應(yīng)用，因此對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行有效的預(yù)處理并在微生物催化轉(zhuǎn)化過程中加入助劑，以提高其轉(zhuǎn)化效率十分必要[6-10]。

作為一種環(huán)境友好的預(yù)處理方式，高溫液態(tài)水預(yù)處理工藝不需要添加任何其他化學(xué)試劑，只利用熱量和水的自催化作用，就可以使生物質(zhì)中的半纖維素發(fā)生降解，從而打破纖維素的天然屏障，增大纖維素可及度，提高纖維素的可降解性和反應(yīng)活性[11-13]。但是高溫液態(tài)水處理過程中，木質(zhì)素的去除率有限[14，15]，大量殘留的木質(zhì)素除了形成物理屏障阻礙纖維素和纖維素酶接觸外，還會(huì)對(duì)纖維素酶進(jìn)行非反應(yīng)性吸附，減少降解纖維素的纖維素酶有效數(shù)量[16-20]。據(jù)報(bào)道，非離子表面活性劑能夠維持酶的活力[21]，并可以通過與木質(zhì)素結(jié)合，屏蔽木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的非反應(yīng)性吸附，從而提高木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化效率[22-24]。因此，本文將天然玉米芯進(jìn)行高溫液態(tài)水預(yù)處理后，采用纖維素酶將其催化降解，酶解過程中添加適量的非離子表面活性劑Tween 80，并研究其對(duì)酶催化過程的促進(jìn)方式及效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料與化學(xué)試劑

玉米芯采自山東省泰安市，自然晾干后粉碎，過篩，封口袋中保存?zhèn)溆?。纖維素酶由白銀賽諾生物科技有限公司提供，其內(nèi)切葡聚糖酶活力為527 IU/g，濾紙酶活力為120 FPU/g，β-葡聚糖苷酶活力為105 IU/g。Tween 80、檸檬酸鈉、檸檬酸、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、無水硫酸鈉、羧甲基纖維素、葡萄糖、硫氰酸銨、硝酸鈷等均為分析純，購自上海麥克林生化科技有限公司，使用前未經(jīng)其他處理。

1.2 高溫液態(tài)水預(yù)處理

按照1：15的固液比將玉米芯和去離子水加入反應(yīng)釜，180℃下反應(yīng)1 h。為防止固體深度降解，到達(dá)反應(yīng)時(shí)間后立即用自來水將反應(yīng)釜冷卻至室溫。反應(yīng)后的固體部分用去離子水清洗備用。

1.3 玉米芯成分分析和結(jié)構(gòu)表征

玉米芯的表面形貌采用PHENOM PRO型臺(tái)式掃描電子顯微鏡觀察，工作電壓5 kV～15 kV，放大倍數(shù)為 500 k～10 k。

玉米芯晶相分析在荷蘭帕納科有限公司的X’Pert 3 Powder型X射線粉末衍射儀上進(jìn)行，Cu靶，Kα輻射源，管電壓40 kV，管電流40 mA，掃描范圍5.0°～40.0°，掃描速度 0.12 °/s。

高溫液態(tài)水預(yù)處理前后玉米芯的成分參考美國可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）的方法進(jìn)行分析[25，26]。

1.4 纖維素酶催化水解

稱取1 g絕干底物置于250 mL錐形瓶中，按固液比1：50加入0.05 mol/L pH 4.8的檸檬酸緩沖液，以20 FPU/g（絕干底物）的量加入纖維素酶，加入適量Tween 80后，振蕩均勻并置于50℃、150 r/min的恒溫振蕩器中反應(yīng)，定期取樣，分別用3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）和考馬斯亮藍(lán)G 250法（Bradford法）檢測(cè)水解液中的還原糖（RS）和蛋白質(zhì)的含量。纖維素酶吸附率計(jì)算式如下：

1.5 Tween 80與玉米芯的吸附

取50 mL 0.05 mol/L pH 4.8的檸檬酸緩沖液，加入1 g玉米芯，0.1 mL Tween 80，置于恒溫振蕩器中，50℃，150 r/min下震蕩90 min，每隔15 min取樣，上清液采用硫氰酸鈷銨溶液顯色法檢測(cè)Tween 80的含量，以不加玉米芯的實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照組，按照下面的公式計(jì)算Tween 80的吸附率：

1.6 Tween 80與纖維素酶的相互作用

分別配制纖維素酶溶液和纖維素酶-Tween 80溶液，用紫外分光光度計(jì)在2 000 nm～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到兩種溶液的紫外光譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 高溫液態(tài)水預(yù)處理對(duì)玉米芯成分和結(jié)構(gòu)的影響

處理前后玉米芯的表面狀況（見圖1），未處理的玉米芯表面比較平滑，質(zhì)地緊密，無明顯的纖維素束狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)過高溫液態(tài)水預(yù)處理后，玉米芯表面結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化，大量纖維暴露出來，從而增大了比表面積，提高了纖維素的可及度，這對(duì)纖維素酶水解纖維素起到積極作用。

處理前后玉米芯結(jié)晶度和成分的變化（見表1）。比較發(fā)現(xiàn)，處理后玉米芯的結(jié)晶度顯著上升，這與基于混合物計(jì)算結(jié)晶度的方法和處理后成分的變化情況有關(guān)。相比天然玉米芯，高溫液態(tài)水處理后的玉米芯中，纖維素得到了明顯富集，半纖維素含量顯著減少，僅有5.89%，而纖維素的富集導(dǎo)致結(jié)晶纖維素在物料中的比例增大，因此結(jié)晶度有所增加。

因此，研究結(jié)果表明，高溫液態(tài)水處理可以有效降解生物質(zhì)中大部分半纖維素，為纖維素酶進(jìn)攻并降解纖維素清掃障礙，然而處理后結(jié)晶度上升，且大量木質(zhì)素保留，這些都會(huì)對(duì)后期纖維素酶催化降解產(chǎn)生不利影響。

2.2 Tween 80、纖維素酶及酶解底物的相互作用

酶解過程中，木質(zhì)素除了對(duì)纖維素起到物理屏蔽作用外，還會(huì)對(duì)纖維素酶進(jìn)行非反應(yīng)性吸附，而吐溫系列表面活性劑的加入會(huì)競(jìng)爭(zhēng)木質(zhì)素上的吸附位點(diǎn)，能夠在一定程度上減少木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的非反應(yīng)性吸附[27]。天然玉米芯對(duì)Tween 80及纖維素酶的吸附曲線（見圖2）。由圖2A可見，Tween 80在玉米芯上有相當(dāng)量的吸附，且約15 min后即可達(dá)到吸附平衡；而圖2B顯示，玉米芯對(duì)纖維素酶的吸附率呈現(xiàn)周期變化，這是因?yàn)槔w維素酶對(duì)纖維素的降解是一個(gè)不斷吸附、反應(yīng)、脫附和再吸附的過程，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合[28]。通過比較發(fā)現(xiàn)，約15 min時(shí)對(duì)照組中玉米芯對(duì)纖維素酶吸附率達(dá)到最高值，后期纖維素酶吸附規(guī)律性較差，周期較長(zhǎng)，添加了Tween 80后，初期纖維素酶吸附率略低于對(duì)照組，而后期纖維素酶的吸附-解吸附規(guī)律性增強(qiáng)，吸附周期縮短，這是由于Tween 80能很快占據(jù)木質(zhì)素上的吸附位點(diǎn)的緣故。結(jié)果說明Tween 80的加入能夠有效改善纖維素酶的吸附-解吸附特性。

圖1 預(yù)處理前后玉米芯的掃描電鏡圖Fig.1 SEM micrographs of raw（A）and pretreated（B）corncobs

表1 高溫液態(tài)水預(yù)處理前后玉米芯結(jié)晶度和成分變化Tab.1 Changes of corncob crystallinity and composition before and after HLW pretreatment

圖2 天然玉米芯對(duì)Tween 80和纖維素酶的吸附Fig.2 Absorption of Tween 80（A）and cellulase（B）by the raw corncob

由纖維素酶以及纖維素酶與Tween 80共存的紫外吸收光譜圖（見圖3）可以看出，由于Tween 80的存在，纖維素酶肽鍵引發(fā)的吸收峰由243 nm紅移到253 nm，可能的原因是Tween 80對(duì)纖維素酶肽鍵的共價(jià)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響[29]，同時(shí)酪氨酸和色氨酸的出峰位置（280 nm左右）也出現(xiàn)了輕微的變化。由于吸附域的結(jié)構(gòu)變化會(huì)影響纖維素酶與底物結(jié)合[30]，因此，雖然Tween 80的添加會(huì)改善纖維素酶的吸附-解吸附性能以利于水解纖維素，但是加入過量也可能嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而抑制纖維素酶的活力，因此需要合理優(yōu)化Tween 80的添加量。

圖3 纖維素酶與Tween 80的紫外吸收光譜Fig.3 UV absorption spectrum of cellulase and Tween 80

2.3 表面活性劑添加量對(duì)酶解過程的影響

利用未處理的玉米芯進(jìn)行酶催化水解，并考察Tween 80添加量對(duì)水解效果的影響，結(jié)果（見圖4），水解72 h后的結(jié)果顯示，Tween 80的添加可對(duì)酶解過程有改善作用。隨著Tween 80添加量的增大，玉米芯經(jīng)纖維素酶水解72 h后，水解液中還原糖的濃度逐漸增大；當(dāng)Tween 80的添加量達(dá)到0.1 mL/g絕干底物時(shí)，還原糖濃度達(dá)到7.41 mg/mL，與未添加Tween 80的對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比，提高了56.99%；進(jìn)一步增加Tween 80的量時(shí)，還原糖濃度開始下降。由此可見，非離子表面活性劑在改善酶解效率方面存在最佳濃度，這與前面2.2的結(jié)論一致?；诒緦?shí)驗(yàn)結(jié)果，Tween 80的最佳添加量為0.1 mL/g絕干底物。

圖4 Tween 80添加量對(duì)酶解過程a的影響Fig.4 Effect of Tween 80 dosage on enzymatic hydrolysis processa

2.4 高溫液態(tài)水預(yù)處理和Tween 80輔助水解的酶解效果

圖5 高溫液態(tài)水處理結(jié)合Tween 80對(duì)酶解過程的影響Fig.5 Effect of HLW pretreatment combined with Tween 80 on enzymatic hydrolysis processa

未經(jīng)預(yù)處理、無表面活性劑添加的對(duì)照組（見圖5），玉米芯酶解產(chǎn)還原糖的量最低，96 h水解液中還原糖的濃度僅為4.50 mg/mL，且由于產(chǎn)物抑制作用，48 h后再延長(zhǎng)酶解時(shí)間對(duì)產(chǎn)糖意義不大；而添加了Tween 80后，不僅酶解全程還原糖濃度有所增加，而且產(chǎn)物的抑制作用也在一定程度上有所減弱，96 h水解液中還原糖濃度比48 h的提高了13.55%；高溫液態(tài)水處理后的玉米芯在酶解過程中添加了Tween 80后，酶解效果提升更明顯，96 h水解液中還原糖濃度達(dá)到17.36 mg/mL，與對(duì)照組相比提升了近三倍。

3 結(jié)論

通過前期高溫液態(tài)水預(yù)處理、后期Tween 80輔助酶解對(duì)天然玉米芯進(jìn)行酶催化降解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)高溫液態(tài)水預(yù)處理打破了天然玉米芯致密的結(jié)構(gòu)，有效去除了半纖維素的物理屏障，使纖維素大量裸露，便于纖維素酶對(duì)其進(jìn)攻并加以降解；纖維素酶解過程中合理添加表面活性劑Tween 80，有效屏蔽了木質(zhì)素的非生產(chǎn)性吸附，改善了纖維素酶吸附-解吸附性質(zhì)，減弱了產(chǎn)物抑制。二者相結(jié)合，最終水解液中還原糖的濃度得到了顯著提高，有效提高了生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率。

將二氧化碳轉(zhuǎn)化為塑料組分的轉(zhuǎn)化技術(shù)

化石燃料長(zhǎng)期以來一直是塑料的前體，但內(nèi)布拉斯加-林肯大學(xué)和歐洲合作者的新研究可能有助于將這個(gè)時(shí)代推向煙-二氧化碳時(shí)代。大氣中完全來自化石燃料燃燒的二氧化碳濃度已從前工業(yè)化時(shí)代的280×10-6增加到今天的約410×10-6。這種趨勢(shì)以及化石燃料的有限供應(yīng)迫使研究人員探索用二氧化碳而不是用石油或天然氣生產(chǎn)塑料的方法。

內(nèi)布拉斯加州的Vitaly Alexandrov及其同事詳細(xì)介紹了一種基于催化劑的技術(shù)，該技術(shù)可將二氧化碳轉(zhuǎn)化為乙烯的量增加一倍，而乙烯是世界上最常見的聚乙烯的重要組成部分?；瘜W(xué)和生物分子工程助教Alexandrov說：“二氧化碳的轉(zhuǎn)化對(duì)幫助消除導(dǎo)致全球變暖和環(huán)境中其他有害過程的排放非常重要。銅已成為將二氧化碳轉(zhuǎn)化為聚合物分子的催化化學(xué)反應(yīng)的主要候選者，當(dāng)施加電壓時(shí)，就發(fā)生催化反應(yīng)。但是一些銅基的設(shè)置未能將超過約15%的二氧化碳轉(zhuǎn)化為乙烯，因產(chǎn)率太小而不能滿足工業(yè)需求?！?/p>

因此，威爾士斯旺西大學(xué)的研究人員決定嘗試用不同聚合物涂覆銅，以提高其效率。用聚丙烯酰胺聚合物涂覆銅后，他們發(fā)現(xiàn)銅泡沫塑料的轉(zhuǎn)化率從13%上升到26%。Alexandrov和博士后研究員Konstantin Klyukin隨后通過內(nèi)布拉斯加州荷蘭計(jì)算中心進(jìn)行基于量子力學(xué)的模擬來幫助解釋聚丙烯酰胺設(shè)法超越其他聚合物的原因。他們發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺分解CO2并將其重新組裝成一對(duì)結(jié)合的C-O化合物，然后在它進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)化學(xué)反應(yīng)時(shí)穩(wěn)定新的分子，它們最終生成乙烯。Alexandrov說：“CO2是一個(gè)非常難處理的分子，因?yàn)樗浅ｋy打斷的雙鍵。這是嘗試將CO2轉(zhuǎn)化為其他分子時(shí)最具挑戰(zhàn)性的部分。不要希望花費(fèi)太多的能量來轉(zhuǎn)化它，否則，就是一種低效率轉(zhuǎn)化反應(yīng)?！毖芯咳藛T希望進(jìn)一步提高效率，Alexandrov說，他們瞄準(zhǔn)更大的目標(biāo)是：將二氧化碳直接轉(zhuǎn)化為能生產(chǎn)塑料袋、容器和薄膜的聚乙烯。Alexandrov說，“實(shí)驗(yàn)主義者要想從簡(jiǎn)單分子，如乙烯，用間歇反應(yīng)合成非常復(fù)雜的分子。投入CO2催化劑，最終生成可以在商店銷售的聚合物結(jié)構(gòu)。但這些分子結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜。這是理解我們創(chuàng)造這種方法的第一步。”

（摘自中外能源2018年第9期）