病毒性心肌炎患兒外周血中心功能、心肌酶譜指標(biāo)、核因子-κB表達(dá)量的變化及核因子-κB與病情的相關(guān)性研究

丁小芹 汪秋春 曾火明 何愛軍

(湖北省孝感市中醫(yī)醫(yī)院兒科，湖北 孝感 432000)

病毒性心肌炎(viralmyocarditis，VMC)是患者心肌被嗜心性病毒感染，致使心肌或者其相關(guān)間質(zhì)的彌漫性或局灶性炎癥[1]。并以單核-巨嗜細(xì)胞及心肌間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤為主要的病理學(xué)特征，同時(shí)伴有一定程度的鄰近心肌細(xì)胞壞死或變性，是小兒心血管科較為常見的一種心血管疾病[2]。由于VMC沒有典型的臨床特征，通常難以引起人們的關(guān)注，當(dāng)患兒的心臟傳導(dǎo)阻滯被感染波及時(shí)，可造成患者驟然死亡[3]。研究[4]顯示，嬰幼兒VMC患者的病死率高達(dá)50%左右，且兒童VMC患者的預(yù)后相對較差，瑞典衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的調(diào)查顯示，VMC疾病的猝死比例已經(jīng)占有10%左右，嚴(yán)重危及患兒的健康及預(yù)后生活質(zhì)量。而NF-κB是一種基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性因子，參與炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因應(yīng)答及機(jī)體防御功能的調(diào)控，與VMC患兒的病情關(guān)系密切[5]。故本文探討VMC患兒外周血中NF-κB表達(dá)量的變化及其與病情的相關(guān)性，為VMC患兒的臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇我院2016年3月至2018年3月收治的VMC患兒106例作為研究對象，根據(jù)病情將其分為休克組、心衰組和無心衰組，并取同期我院門診外科32例患兒作為對照組。其中對照組患兒的心電圖、胸透以及血象較為正常，且近期無感染，其中男18例，女14例，年齡1～12歲，平均(7.26±3.04)歲。休克組15例，其中男8例，女7例，年齡1～13歲，平均(6.87±3.12)歲；心衰組28例，其中男16例，女12例，年齡1～13歲，平均(6.76±3.21)歲；無心衰組63例，其中男34例，女29例，年齡1～12歲，平均(6.94±3.32)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考1999年全國心肌病以及小兒心肌炎學(xué)術(shù)會議制定的《小兒病毒性心肌炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》[6]，具體如下：(1)臨床診斷依據(jù)：心臟擴(kuò)大；心臟綜合征、心源性休克及心功能不全；心肌肌鈣蛋白或者CK-MB陽性；以R波為主的ST-T持續(xù)性改變并伴有動態(tài)變化，房室、竇房傳導(dǎo)阻滯，完全左束或右束支傳導(dǎo)阻滯，呈現(xiàn)成對、多源、多型、成聯(lián)律。異常Q波及低電壓。(2)病原學(xué)診斷依據(jù)：患兒血液中探查到病毒核酸；早期有特異性IgM抗體陽性出現(xiàn)；血壓、糞便中分離到病毒，與第1份血清相比，恢復(fù)期血清降低4倍以上或者一定程度升高。確認(rèn)指標(biāo)，可將病毒自心包、心肌、心內(nèi)膜或者心包穿刺液中分離出來；特異性病毒抗體呈陽性；患兒血液中探查到病毒核酸。(3)判斷標(biāo)準(zhǔn)：至少具有2項(xiàng)以上的臨床診斷依據(jù)，且有一定的病毒感染支持，同時(shí)具有1項(xiàng)病原學(xué)參考依據(jù)，即可診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；(2)首次患病，且年齡≤14歲；(3)此研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)；(4)家屬簽署知情協(xié)議書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有先天性心臟病者；(2)伴有急性傳染性疾??；(3)伴有嚴(yán)重的肝腎功能障礙者；(4)臨床資料不完整；(5)依從性差，中途退出者。分組標(biāo)準(zhǔn)：文中根據(jù)患者的臨床體征及癥狀，將VMC患者分為休克組、心衰組和非心衰組。其中休克組：患兒通常驟然起病，呈現(xiàn)爆發(fā)性經(jīng)過，并以無尿、收縮壓60～80 mmHg、舒張壓0～40 mmHg、肢體發(fā)涼、皮膚濕冷、奔馬律、脈搏細(xì)速、面色蒼白等為主要休克表現(xiàn)，動態(tài)心電圖往往出現(xiàn)心動過緩、室顫、完全性房室傳導(dǎo)阻滯，超聲檢查心功能明顯下降。心衰組：參考第7版《實(shí)用兒科學(xué)》[7]中相關(guān)規(guī)定，存在少尿、雙下肢浮腫、肝臟增大、奔馬律、呼吸心率增快、循環(huán)充血、無其他誘因的煩躁，超聲顯示為心包積液以及心臟擴(kuò)大等改變，X線顯示心博減弱，胸片顯示患者心影擴(kuò)大，動態(tài)心電圖顯示患者存在較為嚴(yán)重的心律失常，同時(shí)伴有一定程度的傳導(dǎo)系統(tǒng)以及其他系統(tǒng)損傷。(3)無心衰組：存在短陣房速、結(jié)性早搏、室早、房早、心電圖ST-T波改變、較輕病癥或者其他非特異性癥狀，另外還具有一定的心動過速、精神不好，多數(shù)患兒在數(shù)周或者數(shù)日內(nèi)即可痊愈。

1.2方法

1.2.1心功能指標(biāo)測定 在所有患兒入院24 h內(nèi)，由同一專門的經(jīng)驗(yàn)豐富的影像科醫(yī)師，采用彩色多普勒超聲診斷儀(ACUSON S2000；德國西門子)對患者的射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(LVFS)、左房內(nèi)徑(LAD)及左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)進(jìn)行測定。

1.2.2血清心肌酶譜測定 于患兒入院次日清晨8～10時(shí)，抽取其5 mL的空腹靜脈血，通過離心機(jī)(Ortho BioVue；強(qiáng)生(上海)醫(yī)療器材有限公司)在離心半徑為10.5 cm、轉(zhuǎn)速3 000 r/min條件下，離心10 min，取其上清液，冰箱-75℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定患兒血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)水平，試劑盒購于北京丹大生物技術(shù)有限公司，操作方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.3外周血中NF-κB表達(dá)水平測定[8-9](1)單核細(xì)胞的標(biāo)記：于患兒入院次日清晨8～10時(shí)，另抽取其5 mL的空腹靜脈血，加入肝素鈉進(jìn)行抗凝處理；將2.5 mL經(jīng)過PE-Cy5標(biāo)記的鼠抗人CD14單抗(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)加入到加樣管中，再將上述經(jīng)過抗凝處理的100 μL血加入其中，振搖，進(jìn)行20 min的避光反應(yīng)。(2)單核細(xì)胞的固定：根據(jù)FIX&PERM試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)中的有關(guān)說明，在加樣管中加入Fixation Medium A 100 μL進(jìn)行固定處理，并在避光條件下進(jìn)行15 min的反應(yīng)，之后在加入PBS 2 mL，離心機(jī)在離心半徑為10.5 cm、轉(zhuǎn)速1 500 r/min條件下，離心5 min，棄去上清液。(3)單核細(xì)胞的破膜及免疫熒光抗體染色處理：根據(jù)上述試劑盒說明書操作規(guī)程，破膜處理需將Permeabilization Medium B 100 μL加入到加樣管中，之后在檢測管中加入5 μL NF-κB P65單抗(經(jīng)PE標(biāo)記)IgG同型免疫球蛋白單抗(安必奇生物科技有限公司)，在對照管中加入5 μL小鼠抗人NF-κB P65單抗(經(jīng)PE標(biāo)記)。振蕩搖勻，避光條件下，進(jìn)行20 min的反應(yīng)，將PBS 2 mL加入到其中，離心機(jī)在離心半徑為10.5 cm、轉(zhuǎn)速1 500 r/min條件下，離心5 min。棄去上清液，將500 μL的生理鹽水加入其中，充分振蕩均勻，最后采用上流式細(xì)胞儀(Gallio型；貝克曼庫爾特)對其NF-κB表達(dá)水平進(jìn)行測定。

2 結(jié) 果

2.1不同病情患兒心功能指標(biāo)比較 對于VMC患者，按照無心衰組、心衰組及休克組的等級分組順序，其EF異常率、LVFS異常率、LAD及LVESD值均明顯升高，且均明顯高于對照組(P<0.05)。

表1 不同病情患兒心功能指標(biāo)比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.2不同病情患兒血清心肌酶譜指標(biāo)比較 對于VMC患者，按照無心衰組、心衰組及休克組的等級分組順序，其ALT、AST、LDH、cTnI、CK-MB及CK水平均明顯升高，且均明顯高于對照組(P<0.05)。

表2 不同病情患兒血清心肌酶譜指標(biāo)比較

注：與對照組相比，#P<0.05。

2.3不同病情患者的外周血中NF-κB表達(dá)水平比較 對于VMC患者，按照無心衰組、心衰組及休克組的等級分組順序，其外周血中NF-κB表達(dá)水平明顯升高，且均明顯高于對照組(P<0.05)。

表3 不同病情患者的外周血中NF-κB表達(dá)水平比較

注：與對照組相比，△P<0.05。

2.4VMC患兒外周血中NF-κB表達(dá)水平與其病情分組等級相關(guān)性分析 VMC患兒外周血中NF-κB表達(dá)水平與VMC患者分組呈現(xiàn)等級正相關(guān)(r=0.641，P<0.05)。

3 討 論

VMC是一種臨床常見的兒科心血管疾病，也是新生兒患兒致死的主要原因之一，嚴(yán)重危及患兒的生命健康。由于VMC所引起的兒童心源性猝死率升高，逐漸受到醫(yī)護(hù)工作者的高度重視。目前臨床上對于其發(fā)病機(jī)制尚未有權(quán)威性解釋，但一般認(rèn)為與病毒感染所致的免疫損傷及心肌損傷有關(guān)[10]。由于超聲心動圖可以對患者心腔功能及大小進(jìn)行直觀的顯示，可以對心肌結(jié)構(gòu)功能病變進(jìn)行預(yù)測。其中EF和LVFS是對患者左心室收縮功能評價(jià)最為常用的指標(biāo)；LVESD是反映其左室收縮功能及收縮末期大小的指標(biāo)；LAD是一種可以判斷心臟擴(kuò)大與否的重要指標(biāo)[11]。本文中結(jié)果提示VMC患者容易累及其左室收縮功能，心臟擴(kuò)大，收縮功能下降，按照無心衰組、心衰組及休克組的順序，其病情逐漸加重。另外，心肌酶譜指標(biāo)是可以反映VMC患兒心肌損傷程度的指標(biāo)，其中ALT、AST、LDH、cTnI、CK-MB及CK是最為常見的幾種心肌酶譜指標(biāo)，也可以相應(yīng)地反映患者病情的嚴(yán)重程度[12]，文中結(jié)果提示VMC患者病情越重，其心肌損傷程度相對越重。

NF-κB是Baltimore和Sen于1986年發(fā)現(xiàn)的一種存在于人體各種細(xì)胞胞漿中的重要轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)也是諸如急性期反應(yīng)蛋白、黏附因子、炎癥介質(zhì)、生長因子、免疫受體、轉(zhuǎn)錄因子及促炎因子等高表達(dá)所必需的轉(zhuǎn)錄因子，在VMC疾病的發(fā)生及進(jìn)展過程中作用顯著[13]。而正常情況下，NF-κB在人體靜止細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中以兩種無活性的狀態(tài)存在(與其前提p105或p100相結(jié)合；與IκB相結(jié)合)，在受到前炎癥因子等多種因素的誘導(dǎo)下，進(jìn)行活化，誘導(dǎo)諸如因子的轉(zhuǎn)錄[14]。文中結(jié)果顯示，隨著VMC病情的加重，患兒外周血中NF-κB表達(dá)水平逐漸升高，兩者呈現(xiàn)等級正相關(guān)，故認(rèn)為NF-κB是一種可以反映VMC患者病情嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo)。這可能是由于機(jī)體內(nèi)部的細(xì)胞因子在VMC疾病病毒誘發(fā)、自身免疫反應(yīng)以及病情進(jìn)展過程中，具有一定的作用[15]。而NF-κB廣泛存在于患者細(xì)胞胞漿中，可以促進(jìn)多種細(xì)胞因子的表達(dá)，調(diào)控VMC患者急性炎癥的發(fā)生及進(jìn)展過程[16]。細(xì)胞中NF-κB在嗜心性病毒的感染誘導(dǎo)下，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)部，對IL-1、TNF-α等原發(fā)性炎性介質(zhì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而進(jìn)一步促進(jìn)更多的繼發(fā)性細(xì)胞介質(zhì)及因子被巨嗜細(xì)胞產(chǎn)生[17]?？傊琋F-κB主要是通過對酶類、化學(xué)因子、炎性因子以及粘附分子等細(xì)胞介質(zhì)及因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)影響而發(fā)揮作用[18]。反過來，大量促炎介質(zhì)的表達(dá)也會進(jìn)一步對NF-κB進(jìn)行激活，進(jìn)而形成級聯(lián)放大效應(yīng)，加重病情的發(fā)展惡化[19]。而Z.Cheng等[20]通過對小鼠模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，INF-γ、TNF-α、IL-1等mRNA的表達(dá)水平升高，而TNF-α為心肌炎癥反應(yīng)中較為重要的炎癥因子，可以對無活性的IκB進(jìn)行降解，進(jìn)而激活NF-κB，造成心肌損傷、凋亡甚至壞死，加重病情，也證實(shí)了本文的觀點(diǎn)。

綜上所述，VMC患兒外周血中NF-κB表達(dá)水平與VMC患兒分組呈現(xiàn)等級正相關(guān)，可以作為VMC患者病情程度判定的重要參考指標(biāo)。