大興安嶺野生盤龍參人工組織培養(yǎng)繁殖

●劉德文 張春英 仲偉利 齊會娟 張 新 湛鑫琳

（黑龍江省大興安嶺地區(qū)農(nóng)林科學(xué)院 黑龍江 加格達(dá)奇 165000）

盤龍參為蘭科盤龍參屬植物，學(xué)名綬草（Spiranthes sinensis.(Pers.)Ames.Orch.），又名龍抱柱、盤龍草，株高15～20cm，莖基部簇生數(shù)條肉質(zhì)根。在黑龍江省大興安嶺地區(qū)呼中、塔河、加格達(dá)奇等地區(qū)有野生分布。盤龍參根或全草入藥，主要含香豆精甙和生物堿，性平，味甘、苦，歸肺經(jīng)、心經(jīng)，有滋陰益氣，涼血解毒，澀精，強(qiáng)壯[1]的功效。由于盤龍參植株天然數(shù)量少，目前在上述地區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)大面積的盤龍參群落，其種子在自然條件下萌發(fā)率低，給人工栽培帶來困難，有效成分難以富集，阻礙了藥用價(jià)值的應(yīng)用。為了更好地開發(fā)利用這一珍貴的寒溫帶藥用資源，本文作者以盤龍參組織培養(yǎng)為目標(biāo)，目的是研究一種以地下隱芽作為外植體進(jìn)行人工組織培養(yǎng)繁殖栽培盤龍參的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以黑龍江省大興安嶺加格達(dá)奇區(qū)野生盤龍參為試驗(yàn)材料。取盤龍參當(dāng)年生地下隱芽為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 取盤龍參隱芽外植體，對其進(jìn)行消毒處理：用自來水沖洗5～10分鐘，用75%的（體積）酒精浸泡1～2分鐘，再分別用0.1%（質(zhì)量）的氯化汞及10%（體積）的次氯酸鈉作消毒劑浸泡消毒，最后用無菌水沖洗3～5次。

不同消毒劑及消毒時(shí)間對比試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng) 外植體消毒后進(jìn)行初代誘導(dǎo)培養(yǎng)。

初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基：改良MS[7]+IAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.8g/L。

將外植體接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，給予2 000～2 500Lux的光照，每天光照時(shí)間為12小時(shí)，培養(yǎng)溫度 22～24℃，培養(yǎng) 20～25 天[2][3]。

表1 外植體消毒劑、消毒時(shí)間對比

圖1 盤龍參外植體-地下隱芽接種

圖2 外植體-地下隱芽接種15天后膨大

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng) 將經(jīng)過初代培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移培養(yǎng)接種于繼代增殖培養(yǎng)基上，給予2 500～3 000Lux的光照，每天光照時(shí)間為16小時(shí)，培養(yǎng)溫度24～26℃，以40～50天為1個(gè)周期進(jìn)行繼待培養(yǎng)[4][8]。

繼代增殖培養(yǎng)基：MS+BAP+GA3+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.8g/L[5][6]。

繼代過程中在培養(yǎng)基中進(jìn)行了不同激素濃度培養(yǎng)試驗(yàn)，其間（接種到繼代增殖培養(yǎng)基20天后）進(jìn)行紅光照射10～15天試驗(yàn)，光強(qiáng)1000～1 500Lux的光照，每天光照時(shí)間為16小時(shí)，培養(yǎng)溫度24～26℃。

不同激素濃度增殖培養(yǎng)基、不同處理叢生芽誘導(dǎo)、增殖對比試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 不同激素濃度增殖培養(yǎng)基、不同處理叢生芽誘導(dǎo)、增殖結(jié)果

圖3 外植體-地下隱芽接種25天后

圖4 叢生芽增殖

1.2.4 生根培養(yǎng) 繼代培養(yǎng)芽不斷繁殖后，將叢生芽在無菌條件下分割成單株，每個(gè)單株保證帶有根原基。將分割后的單株轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，給予1500～2000Lux的光照，每天光照時(shí)間為10小時(shí)，培養(yǎng)溫度 20～25℃，培養(yǎng) 20～25 天[9]。

生根培養(yǎng)基：1/2MS+IBA+蔗糖20g/L+瓊脂粉6.8g/L+活性炭5g/L、1/2MS+NAA+蔗糖20g/L+瓊脂粉6.8g/L+活性炭5g/L。

進(jìn)行不同激素濃度生根培養(yǎng)基生根率對比試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 不同激素濃度生根培養(yǎng)基生根率

1.2.5 試管苗移栽

將已生根的試管苗在培養(yǎng)的試管中不開口移到自然光照下鍛煉5～6天，然后打開棉塞開口煉苗1～2天，再移栽到移栽基質(zhì)中，移栽基質(zhì)為1：1的腐殖質(zhì)和苔蘚混合物。移栽后5～7天內(nèi)保證 85%～90%的空氣濕度，幼苗管理的生長溫度是20～24℃。直到幼苗緩苗成活，完成了盤龍參組織培養(yǎng)繁殖全過程。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑及消毒時(shí)間處理外植體消毒對比試驗(yàn)結(jié)果

10%（體積）的次氯酸鈉作消毒劑消毒效果不好，不能作為盤龍參組織培養(yǎng)外植體消毒劑。

用自來水沖洗5～10分鐘，用75%（體積）的酒精浸泡1分鐘，再用0.1%（質(zhì)量）的氯化汞浸泡4分鐘，無菌水沖洗3～5次，外植體消毒效果最好。污染率最低，成活率最高。

2.2 繼代增殖培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

通過對不同激素濃度增殖培養(yǎng)基、不同處理叢生芽誘導(dǎo)增殖對比試驗(yàn)，得出：增殖培養(yǎng)基MS+BAP2.0mg/L+GA30.5mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂粉6.8g/L表現(xiàn)最好，同時(shí)在繼代增殖培養(yǎng)過程中（接種到繼代增殖培養(yǎng)基20天后）進(jìn)行紅光照射10～15天，光強(qiáng)1000～1500Lux的光照，每天光照時(shí)間為16小時(shí)，培養(yǎng)溫度24～26℃?？商岣咴鲋潮稊?shù)，叢生芽增殖了10倍。

2.3 生根培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

生根培養(yǎng)基：MS+IBA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂粉6.8g/L+活性炭5 g/L，1 500Lux光照，每天光照時(shí)間為10小時(shí)，培養(yǎng)溫度20℃，培養(yǎng)20天后叢生芽生根率可達(dá)80%。

3 結(jié)論

以盤龍參當(dāng)年生地下隱芽為外植體，用自來水沖洗5分鐘，用75%（體積）的酒精浸泡1分鐘，再用0.1%（質(zhì)量）的氯化汞浸泡4分鐘，無菌水沖洗3～5次，外植體滅菌效果最好，成活率高。

初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基：改良MS+IAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.8g/L。2 000Lux的光照，每天光照時(shí)間為 12小時(shí)，培養(yǎng)溫度22～24℃，培養(yǎng) 20～25 天。

繼代增殖培養(yǎng)基MS+BAP2.0mg/L+GA30.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.8g/L，2500Lux的光照，每天光照時(shí)間為16小時(shí)，培養(yǎng)溫度25℃，以40～50天為1個(gè)周期進(jìn)行繼待培養(yǎng)。其間（接種到繼代增殖培養(yǎng)基20天后）進(jìn)行紅光照射10～15天，光強(qiáng)1000～1500Lux的光照，每天光照時(shí)間為16小時(shí)，培養(yǎng)溫度24～26℃。

試管苗生根培養(yǎng)基：MS+IBA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂粉6.8g/L+活性炭5g/L，生根率高。

試管苗移栽基質(zhì)1：1的腐殖質(zhì)和苔蘚混合物。

通過上述試驗(yàn)方法，經(jīng)過初代、繼代增殖、生根培養(yǎng)、移栽，可實(shí)現(xiàn)盤龍參地下芽隱組織培養(yǎng)繁殖。本方法簡捷，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，可操作性強(qiáng)，達(dá)到了快繁的目的，可用于蘭科植物盤龍參的工廠化育苗。盤龍參人工組織培養(yǎng)技術(shù)的研究成功，可為黑龍江省大興安嶺地區(qū)野生資源的開發(fā)利用提供技術(shù)保障。