CaMV35S啟動子及其在轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用和檢測

湯 婷，謝實龍，祝 旋，徐俊鋒，唐 俊，汪小福，*

(1.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

從1996年美國最早開始商業(yè)化生產(chǎn)和銷售轉(zhuǎn)基因作物開始，轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化在爭論中得到迅速發(fā)展。目前，共有40個國家開展了轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化種植。而在轉(zhuǎn)基因作物中，外源目的基因被整合進宿主細(xì)胞時，1個能夠高效啟動目的基因表達的啟動子是必不可少的。啟動子是RNA聚合酶能夠識別并與之結(jié)合，從而促使基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，是決定基因表達時間、部位、強度等的主要調(diào)控元件，是完成基因表達的表達元件中至關(guān)重要的一部分，通常位于基因上游。一個典型的啟動子包括CAAT-box和TATA-box，它們分別是依賴DNA的RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游幾十個堿基處。在核心啟動子上游通常會有一些特殊的DNA序列，即順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合從而激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。一旦RNA聚合酶定位并結(jié)合在啟動子上即可啟動基因轉(zhuǎn)錄，因此，啟動子是基因表達調(diào)控的重要元件，它與RNA聚合酶及其他蛋白輔助因子等反式作用因子的相互作用是啟動子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的實質(zhì)。根據(jù)啟動子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類：組成型啟動子、組織或器官特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子[1-2]。其中，組成型啟動子能在所有組織中都啟動基因表達，具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時空特異性，RNA和蛋白質(zhì)表達量也是相對恒定的。從結(jié)構(gòu)上看，大多數(shù)組成型啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點上游幾百個核苷酸處，都存在核苷酸序列TGACTG[3]。基因工程中，花椰菜花葉病毒(CaMV35S)啟動子被廣泛地使用，其能夠在許多植物物種的幾乎所有發(fā)育階段及所有組織中高效表達，被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植株，如玉米、棉花、大豆、番茄等的構(gòu)建[4]。

1 CaMV35S啟動子簡介

1.1 結(jié)構(gòu)

花椰菜花葉病毒(Cauliflowermosaicvirus，CaMV)是一種感染十字花科成員的DNA病毒。該病毒長度大約8 kb，它的完整核苷酸序列已經(jīng)被確定[5]。在病毒的生命周期中，35S啟動子開啟病毒DNA的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生一個8 kb的轉(zhuǎn)錄本，稱為35S RNA[6]。35S啟動子起始于CaMV 35S RNA轉(zhuǎn)錄起始點-941至+208的Bg l Ⅱ片段，在位于CaMV 35S DNA中的-46至-105區(qū)段存在增強子序列，該啟動子包括TATA盒、倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列和CAAT盒、核心序列4個部分(圖1-A)為CaMV35S序列[7]。1985年，Odell等[8]首次展示了CaMV35S的結(jié)構(gòu)和功能，Jefferson等[9]和Sanders等[10]利用CaMV35S啟動子測量了其在轉(zhuǎn)基因植物葉莖根花中對報告基因的轉(zhuǎn)錄促進能力。Odell等[8]認(rèn)為，CaMV35S啟動子啟動基因轉(zhuǎn)錄要依賴其周圍臨近序列，包括一個TATA框，然而，轉(zhuǎn)錄的速度卻由其上游大約300 bp的分散DNA 序列決定。Simpson等[11]認(rèn)為，這個區(qū)域是一個增強子(能夠提高轉(zhuǎn)錄速率的DNA序列)。Odell等[8]的研究表明，-343至-46的上游片段是35S啟動子的主要部分。在之后的研究中，F(xiàn)ang等[12]發(fā)現(xiàn)35S啟動子可以劃分為2個區(qū)域：從-90 bp至+8 bp為A區(qū)域，主要負(fù)責(zé)基因在胚根、胚乳及根組織內(nèi)表達；區(qū)域B(-343至-90 bp)主要控制基因在胚的子葉、成熟植株的葉組織及維管組織內(nèi)表達。圖1-B展示了CaMV35S序列劃分的不同區(qū)域。在B區(qū)域內(nèi)的增強子序列可以提高表達水平，若是刪除-343至-208區(qū)域，基因的轉(zhuǎn)錄強度減少50%。如果35S啟動子中存在2個B區(qū)將使35S啟動子活性提高10倍，對異源啟動子也有作用，但B區(qū)對某些啟動子起表達阻遏因子作用。

A，35S啟動子從-343到+8的DNA序列，填充三角形表示子域的斷點位置。在方框中，位置-99是ORF VI的終止密碼子 (TGA)，另外2個TGACG和TATA序列。B，CaMV35S的區(qū)域B、區(qū)域A和TATA盒的示意圖。A， The DNA sequence of 35S promoter from-343 to+8， the break point position of the subdomain represented by the triangle. In the box， position-99 was the termination codon (TGA) of ORF VI， and the other two boxes were TGACG and TATA sequences， respectively. B， Schematic diagram of area B， area A and TATA boxes in CaMV35S.圖1 CaMV35S序列及其劃分區(qū)域Fig.1 CaMV35S sequence and its partition region

1.2 CaMV35S啟動子的功能

20世紀(jì)80年代初，Chua和洛克菲勒大學(xué)的合作者在感染了花椰菜花葉病毒(CaMV)的植物中分離出了一種啟動子，該啟動子負(fù)責(zé)花椰菜花葉病毒(CaMV)的整個基因組的轉(zhuǎn)錄表達，它的沉降系數(shù)是35S，因此，這個啟動子被命名為CaMV35S啟動子，它是目前廣泛使用的組成型啟動子之一。已被實驗證實的組成型病毒啟動子有2種，分別為19S和35S。其中，19S啟動子負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄CaMV病毒部分基因，但是沒有35S應(yīng)用廣泛。35S RNA，除了作為翻譯的模板，它的直接末端重復(fù)序列，通過逆轉(zhuǎn)錄酶也可以作為病毒DNA合成的中間產(chǎn)物[13]。另外，Guilley等[6]研究表明，在受感染的細(xì)胞中，病毒快速復(fù)制需要大量的35S RNA，35S RNA的高水平生產(chǎn)證明了這個啟動子的強度。Kuhlemeier等[14]根據(jù)35S轉(zhuǎn)錄起始位點的信息及克隆CaMV序列的可用性，鼓勵使用35S啟動子作為植物基因表達研究的模型系統(tǒng)。Morelli等[15]和Nagy等[16]對轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因矮牽牛花[17]相對轉(zhuǎn)錄水平的定量測定顯示，35S啟動子比NOS啟動子強至少30倍。同時，CaMV35S啟動子具適度的天然啟動能力。因此，在轉(zhuǎn)基因植物中，CaMV35S啟動子被大量地用于外源基因調(diào)控。實驗表明，將包含35S上游序列400～1 000 bp的CaMV片段插入煙草[18-19]或是矮牽?；╗17]的基因，可以顯示出活性。此外，啟動子還可以在幾個雙子葉植物和單子葉植物的原生質(zhì)體中表達[20-23]。

1.3 CaMV35S啟動子的改造

在植物轉(zhuǎn)基因研究中，使用天然啟動子往往不能得到滿意的結(jié)果，尤其是在特異表達或誘導(dǎo)表達時，表達水平不夠理想。因此，選擇合適的啟動子或?qū)幼舆M行改造，是增強外源基因特異表達的重要手段。Lv等[24]將35S最小啟動子結(jié)合在特異表達啟動子GRPp的5′端形成雙向啟動子，這些雙向啟動子能夠指導(dǎo)GUS和GFP基因在所有獨立的轉(zhuǎn)基因煙草的維管特異表達。轉(zhuǎn)基因植物的維管特異性雙元雙向啟動子可用于同時調(diào)控某些維管特異性功能基因的表達。這一方法還可用于其他植物中極性啟動子的生物技術(shù)研究。張秀春等[25]利用植物防御基因中的病原誘導(dǎo)響應(yīng)元件和最小35S啟動子(-62至+1)，人工合成了啟動子SAR，并以GUS基因為報告基因，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中研究人工啟動子的表達特性。結(jié)果表明，SAR啟動子在子葉、毛刺、根莖交接處和根系中優(yōu)勢表達，在老葉的表達量高于幼葉，說明SAR啟動子具有組織和發(fā)育時期表達特異性。彭舒[26]將篩選得到的F-box、GST1-box、S-box、W-box作用元件進行隨機串聯(lián)后與35S最小啟動子進行組合，成功構(gòu)建了人工病原物誘導(dǎo)型啟動子和植物表達載體。Xie等[27]將CaMV35S啟動子上游反向連接了51 bp的Pmini啟動子，改造后的這個啟動子具有雙向表達功能，并且2個方向表達強度相同，同時改造后的雙向啟動子在擬南芥中的遺傳性和穩(wěn)定性表現(xiàn)良好。

2 CaMV35S啟動子在轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用及其檢測方法

2.1 應(yīng)用

自1986年世界上第1例轉(zhuǎn)基因作物問世以來，轉(zhuǎn)基因作物迅猛發(fā)展[28]。轉(zhuǎn)基因作物具有抗蟲、抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等優(yōu)點，使其得到世界范圍的廣泛關(guān)注。根據(jù)全球農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用咨詢署(ISAAA)提供的統(tǒng)計資料，2016年，美國、阿根廷、加拿大等28個以上國家種植了大豆、玉米、棉花、油菜、馬鈴薯等轉(zhuǎn)基因作物。雖然，轉(zhuǎn)基因技術(shù)給人們帶來了巨大的經(jīng)濟效益，但轉(zhuǎn)基因作物及其食品的環(huán)境釋放安全性及食用安全性也存在巨大爭議。為保護貿(mào)易、明確消費，各國政府均對安全監(jiān)管提出了更高的要求[29]。作為轉(zhuǎn)基因作物安全性監(jiān)管的支撐，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)也成為研究的熱點。常用的轉(zhuǎn)基因檢測方法主要有基于蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)和基于DNA的檢測技術(shù)。如酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、Southern雜交、基因芯片和DNA電化學(xué)傳感器技術(shù)等。其中，以PCR為主的基于DNA序列的轉(zhuǎn)基因檢測方法是普遍接受的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)，其有能力從高度加工的材料中擴增特定的DNA片段，其主要依據(jù)是轉(zhuǎn)基因作物中特異性外源DNA片段。用于植物轉(zhuǎn)化的外源DNA片段可以分為通用元件、目的基因、外源載體序列3大類，根據(jù)不同的外源DNA片段，檢測策略可以分為4個層次：篩選檢測、基因特異性檢測、載體特異性檢測和轉(zhuǎn)化事件特異性檢測[30]。其中，最常用的一個元件就是CaMV35S啟動子。數(shù)據(jù)表明，2013年，有來自27種不同物種的336種轉(zhuǎn)基因作物被商業(yè)化[31]，隨著越來越多的轉(zhuǎn)基因作物進入田間試驗，這一數(shù)字還在不斷增加，在此過程中，僅開發(fā)了部分品種的轉(zhuǎn)化事件特性檢測方法。一般來說，在轉(zhuǎn)基因檢測過程中對所有可能發(fā)生的轉(zhuǎn)化事件進行PCR檢測是不可行的。一種常見的做法是對許多轉(zhuǎn)化事件常見的目標(biāo)進行篩選，而CaMV35S啟動子就是這樣的一個常見目標(biāo)。運用轉(zhuǎn)基因作物數(shù)據(jù)庫(http://ceragmc.org/index.php？action5gm_crop_database)中可用的轉(zhuǎn)基因信息，對轉(zhuǎn)基因作物中CaMV35S和TNOS進行了初步的統(tǒng)計分析，結(jié)果見表1。

由表1可知，經(jīng)過批準(zhǔn)的商業(yè)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化事件的65.7%(67/102)包含了CaMV35S啟動子，53.49%(55/102)包含NOS，以及81.4%(83/102)包含任一個或者兩者。在重要的商業(yè)轉(zhuǎn)基因作物中，CaMV35S和TNOS存在比例更高。在轉(zhuǎn)基因玉米(Zeamays)的28個商業(yè)轉(zhuǎn)化事件中，只有1個沒有這2個元件，而在16個商業(yè)的油菜籽(Brassicanapus)中，只有2個例外。一些轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化事件，如轉(zhuǎn)基因玉米BT11、T25和轉(zhuǎn)基因棉花MON531，它們的改造結(jié)構(gòu)中包含了2個CaMV35S序列。

2.2 檢測方法

由于CaMV35S啟動子對轉(zhuǎn)基因作物的檢測具有重要意義，因此，研究者們建立了大量的轉(zhuǎn)基因篩選方法，其中一些方法已被國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)、歐洲聯(lián)盟(歐盟)、中國及其他國家和地區(qū)采用，并作為轉(zhuǎn)基因檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法[32-36]。表2列舉了來自不同文獻和檢測標(biāo)準(zhǔn)的25種檢測CaMV35S啟動子方法[37]，分別命名為M1～M25。其中，M1被ISO 2156915通過，M13被ISO 2157032通過，M1、M14、M11通過了中國的國家標(biāo)準(zhǔn)，M1、M2、M15、M16通過了中國的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，而M1、M4、M12、M14被歐盟數(shù)據(jù)庫收集，用于轉(zhuǎn)基因成分分析。這25種方法包含了10種傳統(tǒng)PCR方法和15種實時定量PCR方法。用于實時定量PCR方法的部分引物對，如M1、M3、M4、M5、M12和M14，也可以用于常規(guī)的定性PCR檢測。另外，表2中也列出了每種方法的引物/探針相對于CaMV序列的位置和擴增子的序列大小。CaMV35S啟動子是GMO中最常修改的元件之一，在不同的基因和載體上，由于來源不同的菌株或在載體構(gòu)建過程中的修飾或突變，CaMV35S啟動子序列可能存在差異[34]。由寡核苷酸序列的比對結(jié)果可知，轉(zhuǎn)化事件176、BT11、T25、MON810和DLL2517中的CaMV35S啟動子序列來源于CaMV基因組[38](圖2)。本課題組收集了玉米、大豆等一些常見轉(zhuǎn)基因作物的不同轉(zhuǎn)化事件中的CaMV35S序列，利用Vector NIT軟件將這些序列進行比對，結(jié)果顯示，這些轉(zhuǎn)化事件中CaMV35S序列存在一定差異，所有比對的CaMV35S序列都不完全一致(圖2)。因此，許多基于CaMV35S啟動子的檢測方法可用于轉(zhuǎn)基因檢測，但是只有部分方法通過了必要的驗證過程和實驗室內(nèi)對少量的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化事件方法驗證。Morisset等[39]在TC1507玉米的CaMV35S序列中發(fā)現(xiàn)了一個單核苷酸多態(tài)性(SNP)，檢測引物/探針的結(jié)合位點出現(xiàn)SNP導(dǎo)致CaMV35S擴增效率不高。國際生命科學(xué)研究所(ILSI)請求100多個實驗室使用CaMV35S和TNOS來檢測轉(zhuǎn)基因作物，一些實驗室在CaMV35S測試中遇到了方法學(xué)缺陷，如靈敏度低、重現(xiàn)性低、誤報或否定。Holden等[40]用8種玉米參考材料測試了5種基于CaMV35S的方法的適用性，結(jié)果表明，2種方法在一些測試材料中存在線性回歸參數(shù)的缺陷和多重PCR擴增的缺陷。如果在轉(zhuǎn)換載體或育種過程中，測試樣品攜帶的CaMV35S序列被改變，那么該方法的差異性可能會導(dǎo)致不同的測試結(jié)果。ILSI的調(diào)查顯示，大部分參與實驗的實驗室都希望有一種標(biāo)準(zhǔn)化的方法，這種方法可以產(chǎn)生一致的檢測結(jié)果，而且實驗的重現(xiàn)性更好。綜合比較現(xiàn)有方法，還沒有最優(yōu)的方法可用。

表1轉(zhuǎn)基因作物中含有的CaMV35S和TNOS數(shù)據(jù)統(tǒng)計

Table1Data statistics of CaMV35S and TNOS included in transgenic crops

作物Crops轉(zhuǎn)化事件數(shù)量Event numberCaMV35STNOS兩個者中至少有一個Both or either大豆Soybean11636玉米Maize28231727棉花Cotton12779阿根廷油菜Argentine canola167914大米Rice5435小麥Wheat1111亞麻Flax1000木瓜Papaya2222李子Plum1111苜蓿Alfalfa1000土豆Potato6566甜菜Sugar beet3212煙草Tabacco2000番茄Tomato6535南瓜Squash2202甜瓜Melon1000菊苣Chicory1011康乃馨Carnation1111波蘭油菜Polish canola2101總計Total102675583

數(shù)據(jù)來源于文獻[40].

Data came from literature [40].

表2用于檢測CaMV35S啟動子的定性和實時定量PCR系統(tǒng)中使用的引物和熒光探針

Table2Primers and fluorescent probes used in detection of CaMV35S promoter in qualitative and real-time quantitative PCR systems

方法Methods方向Orientation名稱Names序列Sequence (5'-3')位置Position擴增大小Amplicon/bpM1Forward35S-1GCTCCTACAAATGCCATCA7190-7208195Reverse35S-2GATAGTGGGATTGTGCGTCA7365-7384Probe35S coreTCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCA7346-7371M2Forward35S-F3CGACAGTGGTCCCAAAGA7248-726574Reverse35S-R3AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC7300-7321Probe35S-PTGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC7266-7290M3ForwardP35S 1-5'ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT7334-7358101ReverseP35S 2-3'CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT7410-7434ProbeP35S-TaqCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT7376-7402M4ForwardSFCGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG7316-733779ReverseSRTCTTGCGAAGGATAGTGGGATT7373-7394ProbeP-35S_3-PTCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCA7346-7371M5Forward35SFZ1CCGACAGTGGTCCCAAAGATGGAC7247-7270162Reverse35SFZ2ATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGG7384-7408Probe35S coreTCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCA7346-7371M6ForwardP-35S_4-LGACGTAAGGGATGACGCACAA7354-737481ReverseP-35S_4-RCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT7410-7434ProbeP-35S_4-PCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTC7376-7400M7Forward35S-promoter.forGACATTGCGATAAAGGAAAGGC7205-722668Reverse35S-promoter.revGGGTCCATCTTTGGGACCA7254-7272Probe35Spromoter-specificATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACA7228-7252M8Forward35SFCCTACAAATGCCATCATTGCG7193-7213205Reverse35SRGGGTCTTGCGAAGGATAGTG7378-7397Probe35SWolfCAAAGATGGACCCCCACCCACG7260-7281M9Forward3-16fCGTCTTCAAAGCAAGTGGAT7316-7335105Reverse3-100rGAAGGGTCTTGCGAAGGA7383-7400Probe3-67tACGCACAATCCCACTA7367-7382M10ForwardP-35S_31-LAGACTGGCGAACAGTTCATACAGA6956-6979188ReverseP-35S_31-RTGCTCCACCATGTTGACGAAG7124-7142ProbeP-35S_31-PACGCACAATCCCACTA7011-7031M11ForwardP-35S-AFAAGATGCCTCTGCCGACAGT7235-7254142ReverseP-35S-ARGATTGTGCGTCATCCCTTAC7357-7376ProbeP-35SGAACGTCTTCTTTTTCCACGAT7280-7309M12ForwardP180-FGCTCCTCGGCCTCTGCCGACAGTGGT7240-725782ReverseP180-RAAGACGTGGTTGGAACGTCTTC7300-7321ProbeP180-PCAAAGATGGACCCCCACCCACG7260-7281M13ForwardP-35S-FGACGTAAGGGATGACGCACAA7354-737481ReverseP-35S-RCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT7410-7434ProbeP-35S-PCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCC7376-7401M14ForwardP35S-cf3CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG7313-7333123ReverseP35S-cr4TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC7411-7435Probe35S coreTCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCA7346-7371M15Forward35S-FGCTCCTACAAATGCCATCATTGC7190-7212195Reverse35S-RGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC7361-7384M16Forward35S-F2TCATCCCTTACGTCAGTGGAG7347-7367165Reverse35S-R2CCATCATTGCGATAAAGGAAA7203-7223M17Forward35SFZMP1(U-35S)CCGACAGTGGTCCCAAAGATG7247-7267158Reverse35SFZMP2(D-35S)AGAGGAAGGGTCTTGCGAAGG7384-7404M18ForwardSP1 FTTGCTTTGAAGACGTGGTTG7310-7329196

續(xù)表2

目前，針對CaMV35S的轉(zhuǎn)基因成分快速篩查檢測，迫切需要找到不同CaMV35S序列中的保守序列，根據(jù)這這段保守序列，設(shè)計相應(yīng)的引物進行檢測，能夠同時滿足不同轉(zhuǎn)基因作物中CaMV35S的檢測需要，避免由于CaMV35S序列差異而造成的不同檢測結(jié)果，從而建立檢測CaMV35S的統(tǒng)一方法。

圖2 十七個轉(zhuǎn)化事件中CaMV35S序列比對結(jié)果Fig.2 Alignment results of CaMV35S sequence in 17 conversion events

3 展望

轉(zhuǎn)基因食品及其安全問題近年來已經(jīng)成為全球關(guān)注的熱點[41-43]，世界各國紛紛出臺政策，要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行限量標(biāo)識。我國于2001年和2002年先后發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》等配套管理辦法，明確規(guī)定對進入我國流通市場的轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品實施標(biāo)識制度。目前，基于DNA的PCR技術(shù)是轉(zhuǎn)基因成分檢測的最主要手段。根據(jù)檢測目標(biāo)及特異性的差異可將PCR技術(shù)分為：篩查檢測、基因檢測、構(gòu)建檢測及轉(zhuǎn)化體特異性檢測。其中，篩查檢測的目標(biāo)主要是轉(zhuǎn)基因作物中常用的一些共用元件，如啟動子、終止子及標(biāo)記基因，雖然其特異性不強，但因為針對的是共用元件的檢測，其檢測的覆蓋率最高。在日常檢測中，面對大量的檢測樣品，篩查檢測是最主要的前期檢測方法，CaMV35S啟動子是轉(zhuǎn)基因成分篩查檢測的主要元件之一。

目前，檢測CaMV35S啟動子的PCR方法中存在以下問題：首先，針對CaMV35S啟動子的檢測引物繁多，只有一部分是來自ISO標(biāo)準(zhǔn)，或相應(yīng)國家或地區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過了實驗室研究和實驗之間的驗證過程，多數(shù)引物是各個實驗室內(nèi)部開發(fā)的；這些引物針對的CaMV35S啟動子序列不同，所以會產(chǎn)生不一致的檢測結(jié)果，從而給轉(zhuǎn)基因成分檢測的結(jié)果及后續(xù)的監(jiān)測和監(jiān)管造成巨大影響；尤其是處在全球貿(mào)易的今天，針對進出口產(chǎn)品的檢測結(jié)果差異會造成一定的貿(mào)易爭端。其次，面對這些多而雜的檢測方法，給檢測者造成了選擇困難；針對不同的檢測樣品，在眾多方法中選擇一種簡便準(zhǔn)確的檢測方法具有一定的難度。所以，建立標(biāo)準(zhǔn)化的CaMV35S啟動子檢測方法很重要。但是，由于目前檢測機構(gòu)或研究室之間的實驗數(shù)據(jù)還沒有做到全面共享和互用。目前，還沒有一個數(shù)據(jù)庫包含了目前所有轉(zhuǎn)基因作物的全部序列信息，包括CaMV35S啟動子序列信息，因此很難建立一種標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法。在今后的研究中，針對CaMV35S啟動子檢測方法的研究，相關(guān)轉(zhuǎn)基因作物的序列信息及檢測數(shù)據(jù)需要進行交流和共享，從而使檢測人員了解相應(yīng)轉(zhuǎn)化體中CaMV35S啟動子的應(yīng)用情況，以及設(shè)計的檢測引物的覆蓋率。同時各個檢測機構(gòu)或?qū)嶒炇抑g需要展開數(shù)據(jù)共享與共同驗證，建立針對CaMV35S啟動子的相對統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。