基于TaqMan PCR鑒定豬源性成分的引物和探針研發(fā)

郭 梁，李春冬，徐偉良，郭元晟

(1.錫林郭勒職業(yè)學院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000； 2.錫林郭勒生物工程研究院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000； 3.錫林郭勒食品檢驗檢測和風險評估中心，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000)

動物源性成分是指動物組織以及蛋和奶，包括肉類及其制品(含動物臟器)、水生動物產(chǎn)品等食品或飼料。動物源性檢測是指從動物源性食品(肉制品、乳制品等)以及飼料中檢測其源性成分的過程。動物肉類、乳制品為人類的生命活動提供了豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和B族維生素等，是人們生活的重要食品[1]。在利益的驅(qū)動下，食品加工、流通和餐飲領(lǐng)域中摻假事件時有發(fā)生，一些不法商販、企業(yè)用低價肉或非肉成分經(jīng)香精處理后冒充高價肉。這些摻雜使假行為不僅嚴重侵害了消費者利益，有時還會產(chǎn)生不良的社會影響，如果問題產(chǎn)品出口到國外更會損害我國食品企業(yè)的整體形象進而影響出口貿(mào)易[2]。還有一些商家廠家為牟取利益隱瞞或更改說明書成分甚至生產(chǎn)假冒偽劣產(chǎn)品[3]。動物源性檢測可以有效保護消費者合法權(quán)利、民族利益、宗教信仰，還能防止牛海綿狀腦病(BSE)、傳染性海綿狀腦病(TSE)、瘋牛病(MCD)以及口蹄疫(FMD)等人畜傳染病的傳播[4-5]。目前，動物源性檢測依賴TaKaRa(日資企業(yè))所生產(chǎn)的試劑盒，缺乏自主性，作為肉類產(chǎn)品基地的錫林郭勒盟迫切需要研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的動物源性檢測試劑盒。

近年來，隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展和人們生活水平的日益提高，一方面動物源性食品與人們?nèi)粘Ｉ畹年P(guān)系愈來愈密切，另一方面消費者對食品的衛(wèi)生安全有了更高要求[6]。目前，動物源性成分檢測技術(shù)大多數(shù)都是建立在對樣品蛋白質(zhì)、DNA、脂肪酸等分子結(jié)構(gòu)、序列或組成特異性分析的基礎(chǔ)上。涉及的技術(shù)手段包括酶聯(lián)免疫(ELISA)、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、電泳、色譜、生物傳感分析等[7]。DNA是一種相當穩(wěn)定的有機分子，在強烈的加熱處理之后仍能保持其穩(wěn)定性[8]，因此，以DNA為基礎(chǔ)的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)法的應(yīng)用最為廣泛。其中實時熒光PCR(real-time fluorescent polymerase chain reaction，RT-PCR)法，以它高通量、高效率等優(yōu)點脫穎而出。RT-PCR技術(shù)是基于使用熒光染料(SYBR GreenⅠ)或探針(TaqMan)，其能夠通過對每個循環(huán)的擴增產(chǎn)物進行實時監(jiān)測而實現(xiàn)對DNA模板進行相對定量。Walker等[9]用SYBR GreenⅠ PCR法檢測了豬、雞和牛等反芻動物DNA。Fajardo等[10]利用SYBR Green檢測系統(tǒng)開發(fā)了快速實時聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)，成功檢測出肉類中的紅鹿、小鹿和獐鹿源性成分。Zhang等[11]使用TaqMan實時PCR法來定量檢測肉、牛奶和奶酪中的DNA。Pegels等[12]開發(fā)了一種TaqMan實時PCR方法，用于檢測動物飼料中雞、火雞、鴨和鵝源性成分。TaqMan PCR方法具有特異性強、靈敏度高、可重復、快速等優(yōu)點。

本研究計劃通過比對豬、牛、羊、馬、雞、鴨、兔、鵝8種動物的線粒體基因組，篩選豬特異的引物和探針組合進行熒光定量PCR，研發(fā)具有高度特異性和靈敏度的引物和探針，以期為政府食藥部門的檢測和監(jiān)管提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的豬肉(1、2、3、4、5號樣品分別來源于錫林浩特市本地5家商店)，羊肉、牛肉、馬肉、雞肉、鴨肉、兔肉、鵝肉、豬肉火腿腸(雙匯集團)購買于錫林浩特市本地農(nóng)貿(mào)市場，各500 g。

Probe qPCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；電泳上樣緩沖液和瓊脂糖(大連寶生物工程有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)和T100 PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)；2000c Nanodrop 分光光度計(美國Thermo Fisher公司)；7300plus實時熒光PCR擴增儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

將8種動物的新鮮肉樣用液氮研磨，利用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)法提取其DNA，方法如下：稱取適量研磨好的樣品約50 mg，置于1.5 mL離心管中，加入DNA裂解液800 μL，旋渦混勻，在65 ℃金屬浴30 min，期間不時振蕩混勻；13 000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上清于潔凈離心管中，加入等體積三氯甲烷/異戊醇(體積比24∶1)混合液，充分混勻，13 000 r·min-1離心5 min，取上清液于新的離心管中加入等體積的異丙醇，充分混勻，13 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，75%乙醇洗滌一次，晾干，加入適量的ddH2O溶解，通過2000c Nanodrop 分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳評價所提取DNA的濃度和質(zhì)量，最終將母液稀釋至100 ng·μL-1左右上樣。

1.2.2 DNA含量的測定

對提取的DNA含量及純度進行測定，用D260/D280的比值來進行質(zhì)量評定，一般比值在1.8～2.0為模板質(zhì)量較好，說明所提的DNA可以滿足后續(xù)實驗要求。

1.2.3 引物設(shè)計與合成

通過比對豬、牛、羊、馬、雞、鴨、兔、鵝8種動物的線粒體基因組，篩選豬特異的序列，利用Primer5軟件進行正向引物(LP: 5′-AGAAATGGGCTACATT(T/C)TCT-3′)、反向引物(RP: 5′-TTTACTGCTAAATCCTCCTT-3′)和探針(5′-ROX-CATAAGAATACCCACCATACGAAAGTTTTTAT-BHQ2-3′)的設(shè)計。引物和探針由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.4 實時熒光PCR擴增反應(yīng)體系

10 μL Probe qPCR SuperMix、正向引物LP和反向引物RP各1 μL(10 μmol·L-1)、探針1 μL、ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸31 s，40個循環(huán)。每個循環(huán)到退火階段收集熒光信號，Ct值小于35且曲線有明顯的對數(shù)增長，結(jié)果判定為有效數(shù)據(jù)，反之判定為無效數(shù)據(jù)。

1.2.5 引物和探針特異性驗證

提取豬、牛、羊、馬、雞、鴨、兔、鵝8種動物的肌肉組織DNA，分別對其用熒光定量PCR的方法進行驗證。根據(jù)各反應(yīng)體系的Ct值來驗證所設(shè)計的引物和探針的特異性。

1.2.6 定量檢測標準曲線的構(gòu)建

對提取的豬肉DNA模板進行梯度稀釋，應(yīng)用1.2.3節(jié)的引物和探針對其DNA進行熒光定量PCR反應(yīng)，以Ct值作縱坐標，模板DNA的質(zhì)量濃度作橫坐標，建立回歸方程。

1.2.7 檢測靈敏度實驗

將豬的肌肉基因組DNA分別稀釋101～107(共10個模板濃度梯度)，在熒光定量PCR檢測反應(yīng)的基礎(chǔ)上分別以LP和RP為引物，以不同稀

釋濃度的樣品DNA為模板進行熒光定量PCR擴增反應(yīng)程序，反應(yīng)條件同1.2.4節(jié)，進行靈敏度的檢測實驗。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

利用7300plus實時熒光PCR擴增儀自帶分析軟件對結(jié)果進行擴增曲線和循環(huán)閾(cycle threshold，Ct)的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR豬特異性擴增結(jié)果

通過自主研發(fā)的豬特異性引物和探針對8種動物的肌肉基因組DNA(稀釋液為模板)進行熒光定量PCR(TaqMan探針方法)擴增實驗。由圖1和表1可知，只有豬的5個肌肉樣品出現(xiàn)典型擴增曲線，Ct值分別為13.32±0.36、13.84±0.79、14.23±1.50、14.10±1.01、14.26±0.92；其他7種動物的肌肉基因組DNA均未出現(xiàn)典型擴增曲線。

圖1 利用TaqMan PCR對8種動物肌肉組織進行豬源性檢測結(jié)果Fig.1 Identification of porcine-derived materials inferred from TaqMan PCR

表1八種動物肌肉基因組DNA的抽提評價以及熒光定量PCR的Ct值

Table1Evaluation of extraction of DNA and Ct values from eight kinds of meat

樣品Sample基因組DNA Genomic DNA母液DNASolution DNA/(ng·μL-1)稀釋液DNADilution DNA/(ng·μL-1)D260/D280Ct 值 Ct value平行實驗1Replicate 1平行實驗2Replicate 2平行實驗3Replicate 3平均值±標準差A(yù)verage±SD豬肉1158.0129.11.8913.6913.3012.9813.32±0.36Pork2244.2117.81.8713.5113.2714.7513.84±0.793667.4113.61.8314.6912.5515.4414.23±1.504260.7120.41.9214.3812.9914.9514.10±1.015187.6127.01.9814.6013.2214.9714.26±0.92羊肉 Mutton241.4119.91.910000牛肉 Beef140.0105.91.890000馬肉 Horsemeat377.4121.11.890000雞肉 Chicken255.5105.91.890000鴨肉 Duck273.1122.71.900000兔肉 Rabbit301.0108.41.860000鵝肉 Goose200.3102.81.850000

2.2 熒光定量PCR檢測靈敏度擴增結(jié)果

將豬的肌肉基因組DNA分別稀釋101～107(共10個模板濃度梯度)進行引物和探針的檢測靈敏度擴增實驗。由圖2和表2可知，稀釋105倍的豬基因組DNA樣本出現(xiàn)典型擴增曲線，Ct值為33.43±0.34，小于35，此時稀釋的豬基因組DNA的濃度是1 pg·μL-1；小于105稀釋的樣本均出現(xiàn)典型擴增曲線，而且隨著模板稀釋的進行，Ct值逐漸變大；當豬基因組DNA稀釋至106倍時，雖然3個平行實驗都出現(xiàn)典型擴增曲線，但是Ct值已經(jīng)大于35；隨著稀釋至107，3個平行實驗中有1個未出現(xiàn)擴增曲線，說明已經(jīng)達到檢測極限。綜上，本研究自主研發(fā)的豬特異性引物和探針的檢測靈敏度較高，可達到1 pg·μL-1。

2.3 豬源性成分定量檢測結(jié)果

利用豬DNA做標準曲線定量檢測肉制品中豬源性成分的含量。將豬DNA分別稀釋101～107(共10個模板濃度梯度)進行引物和探針的

檢測，制作豬源性定量檢測標準曲線(圖3)。通過將檢測肉制品的相應(yīng)源性的Ct值帶入標準曲線中的公式可以得到肉制品中豬源性的定量檢測結(jié)果。用實時熒光PCR檢測加工肉制品(豬肉火腿腸)各5個樣品，Ct值分別是15.05、14.79、15.74、15.57、15.56。通過豬的標準曲線計算相應(yīng)的濃度值為141.25、165.96、91.2、102.33、102.33 ng·μL-1，與實際的濃度值100 ng·μL-1符合程度較高。以上結(jié)果說明所研發(fā)的動物源性檢測的引物和探針具有較好的定量檢測能力。

圖2 豬源性檢測的檢測靈敏度結(jié)果Fig.2 Detection limit using the primers and probe for pork

表2不同稀釋倍數(shù)豬DNA熒光定量PCR的Ct值

Table2Ct values for different diluted DNA from pork

基因組DNAGenomic DNA/(ng·μL-1)Ct值 Ct value平行實驗1Replicate 1平行實驗2Replicate 2平行實驗3Replicate 3平均值±標準差A(yù)verage±SD10017.1515.3914.6615.73±1.281021.6316.8817.2718.60±2.64121.5025.1725.6024.09±2.250.529.3323.3826.7226.48±2.980.127.8125.8126.6026.74±1.010.0527.0827.4027.3627.28±0.180.0130.8330.4830.7030.67±0.170.00133.8133.1833.2933.43±0.340.000137.8638.9238.8838.55±0.600.000010.0038.8936.42

圖3 豬源性定量檢測標準曲線Fig.3 Standard curve for quantification of pork

3 結(jié)論與討論

本研究通過比對豬、牛、羊、馬、雞、鴨、兔、鵝8種動物的線粒體基因組，篩選豬特異序列區(qū)域設(shè)計引物和探針組合，以8種動物的肌肉組織基因組DNA為模板進行熒光定量PCR。結(jié)果表明：所研發(fā)的針對豬源性檢測的引物和探針具有高度的特異性，僅對豬相關(guān)DNA模板有典型擴增曲線，對其他動物來源的DNA模板無擴增反應(yīng)。檢測靈敏度實驗表明，以引物和探針為基礎(chǔ)的檢測方法具有高度的靈敏性，可達1 pg級。肉制品中豬源性定量檢測實驗說明，此方法具有較好的定量檢測能力。綜上所述，以研發(fā)的引物和探針為基礎(chǔ)的檢測方法可為肉及肉制品中豬源性的檢驗檢測提供技術(shù)保障。

在常規(guī)的PCR源性檢測中，檢測人員通?；ù罅康臅r間進行重復實驗工作，而且每一個樣品都需要進行一系列實驗才能得出檢測結(jié)果[13]，且敏感性與特異性也比較低；而本實驗建立的熒光定量PCR方法可以快速、準確、穩(wěn)定地檢測出動物源性成分，具有較高的特異性，優(yōu)于李鑫等[14]基于普通PCR技術(shù)檢測食品中豬源性成分的靈敏度(100 pg)；與徐瓊等[15]、王晶晶等[16]建立的TaqMan熒光PCR技術(shù)檢測豬源性成分的靈敏度和特異性相比有一定的優(yōu)越性。此外，本實驗研發(fā)的檢測豬源性的引物和探針在市售豬肉火腿腸中也能成功檢測其源性，跟商品所標志的成分一致，證明本方法具有特異性和靈敏度較高及適用性廣等優(yōu)點。