翹嘴鲌生長激素基因側(cè)翼2個微衛(wèi)星位點與生長性狀的關聯(lián)分析

劉士力，蔣文枰，程 順，遲美麗，鄭建波，賈永義，*，趙金良，顧志敏

(1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室/浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，浙江 湖州 313001； 2.上海海洋大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306； 3.上海海洋大學 上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術研究中心，上海 201306； 4.上海海洋大學 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306)

生長激素基因(growth hormone，GH)是影響動物生長性狀的主效基因[1]，具有提高飼料轉(zhuǎn)化率[2]、促進肌肉中的蛋白質(zhì)合成[3]、加速魚類骨骼縱向生長[4]等重要作用。作為生產(chǎn)性能的候選基因，已經(jīng)有不少學者在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[5]、豬(Susscrofa)[6]、牛(Bostaurus)[7]、雞(Gallusgallus)[8]等物種上做過研究，并發(fā)現(xiàn)了一些與重要經(jīng)濟性狀相關的多態(tài)位點。微衛(wèi)星和小衛(wèi)星存在于數(shù)種魚GH基因的啟動子或內(nèi)含子中，包括尖吻鱸(Latescalcarifer)[9]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[10]和金頭鯛(Sparusaurata)[11]等。當串聯(lián)重復序列位于基因的調(diào)控區(qū)域時，它們可以直接影響其表達，從而引起這些基因數(shù)量性狀的變化[12]。正是這些序列重復數(shù)目和長度的不同導致了GH基因的多態(tài)性。

翹嘴鲌(CulteralburnusBasilewsky)是鲌亞科中體型最大的一種魚類，其肉白而細嫩，味美而不腥，具有重要的經(jīng)濟價值。翹嘴鲌又稱翹嘴紅鲌、白條魚、大白魚等，廣泛分布于中國各大水系[13]。此外，翹嘴鲌是以活魚為主食的兇猛肉食性魚類，對維持淡水水域生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要作用。采用分子標記技術為輔助手段可以提供育種效率，已開發(fā)了一些翹嘴鲌微衛(wèi)星引物[14-15]，但對于明確的重要功能基因的遺傳標記研究較少，暫未發(fā)現(xiàn)與生長性狀顯著相關的標記[16]。關于翹嘴鲌GH基因與側(cè)翼區(qū)的序列已被報道[17]，翹嘴鲌GH基因內(nèi)含子中不包含微衛(wèi)星序列，但在其側(cè)翼兩端各包含1個微衛(wèi)星序列。本實驗通過引物設計、PCR擴增、片段分型和數(shù)據(jù)分析，研究這2個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性，并將微衛(wèi)星基因型和翹嘴鲌的體長、體質(zhì)量進行相關性分析，以期為翹嘴鲌的微衛(wèi)星特征研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用翹嘴鲌采自浙江省淡水水產(chǎn)研究所綜合實驗基地，為同塘養(yǎng)殖的翹嘴鲌個體，且苗種來源于同一批次繁殖的后代。剪取少量尾鰭，用無水乙醇消毒后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：PCR反應試劑購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；用于DNA提取的試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用苯酚-氯仿法提取樣本DNA。用1%瓊脂糖凝膠檢測提取DNA完整性，DNA原液于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計

根據(jù)GenBank公布的翹嘴鲌GH基因及其側(cè)翼DNA序列(登錄號：KX925976.1)，利用Primer 6.0軟件設計2對特異性引物用于2個微衛(wèi)星位點的擴增，上游引物的5端加上Tail A堿基序列[18]，通用引物Tail A 5端用FAM進行修飾。具體引物序列見表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR反應體系

PCR反應體系20 μL: PCR Mix 10 μL，模板DNA (10 ng·μL-1) 1 μL，通用引物Tail A、上游和下游引物(10 μmol·L-1)分別為0.2 μL、0.2 μL和0.4 μL，滅菌超純水補足體系。

PCR反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 90 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；60 ℃30 min；4 ℃保存。

1.2.4 微衛(wèi)星分型

PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行微衛(wèi)星分型。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用POPGENE 1.3.1計算2個微衛(wèi)星座位在該群體內(nèi)的觀測等位基因數(shù)(observed number of alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，Ne)、觀察雜合度(observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)和多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)。運用SPSS 13.0的一般線性模型(general linear model，GLM)程序分析2個微衛(wèi)星位點與翹嘴鲌體質(zhì)量、體長的關系。顯著性分析用單因素方差分析(ANOVA)的Duncan氏法進行多重比較，P<0.05為差異顯著。結(jié)果以平均值±標準誤表示。統(tǒng)計模型如下：

Yij=μ+Gi+eij

其中：Yij為生長性狀第i個基因型第j尾個體的觀測值，μ為實驗觀測所有個體的平均值，Gi為微衛(wèi)星標記第i種基因型的固定效應，eij為對應于觀測值的隨機誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 翹嘴鲌GH基因側(cè)翼微衛(wèi)星位點

PCR擴增產(chǎn)物的電泳條帶清晰、無雜帶，片段長度為300～500 bp，其大小與預期結(jié)果一致。根據(jù)原始序列(GeneBank登錄號：KX925976.1)設計的原始引物擴增PCR產(chǎn)物大小分別為392、366 bp，加上使用的接頭Tail A為15 bp，預計擴增的產(chǎn)物大小為407、381 bp。2個微衛(wèi)星位點在24個樣本中的微衛(wèi)星分型結(jié)果表明，位點Cal-GH01檢測到404、407和410共3種等位基因，位點Cal-GH02檢測到366、375、378、381、384和387共6種等位基因(圖1)。這2個微衛(wèi)星位點均為3堿基重復，同一位點的不同等位基因之間的長度差異為3個堿基或其整數(shù)倍。因此，判斷PCR結(jié)果準確，據(jù)此可初步確定獲得正確的目的片段，可用于后續(xù)分析。

表1翹嘴鲌GH基因側(cè)翼微衛(wèi)星引物序列

Table1Primer sequences used for microsatellite amplification in the flanking regions ofCulteralburnusGHgene

引物名稱Primers names序列(5'-3')Sequence (5'-3')產(chǎn)物長度Length/bp重復核心Repeat motifTail AFAM-GCCTCCCTCGCGCCACal-GH01-FGCCTCCCTCGCGCCACGGTAGACAGTCATCAGAAT407(AAT)8Cal-GH01-RCCACAACCATCCAATCAATTCal-GH02-FGCCTCCCTCGCGCCAACATCCTTCCAGAATCCTTC381(CTT)5 (TAA) 7Cal-GH02-RCAACCTACGCTACCATCTAA

正向引物中加下劃線的序列為Tail A序列。

Underlined sequence in the forward primer signified the Tail A.

A-1和A-2為Cal-GH01；B-1和B-2為Cal-GH02。A-1 and A-2， Cal-GH01; B-1 and B-2， Cal-GH02.圖1 翹嘴鲌GH基因側(cè)翼2個微衛(wèi)星位點Cal-GH01和Cal-GH02的分型圖Fig.1 Genotyping map of microsatellite loci Cal-GH01 and Cal-GH02 in flanking regions of Culter alburnus GH gene

2.2 等位基因頻率和基因型頻率

120尾翹嘴鲌GH基因側(cè)翼2個微衛(wèi)星位點上共檢測到9個等位基因(表2)。微衛(wèi)星座位Cal-GH01檢測到3個等位基因，分別為404、407和410 bp，對應的微衛(wèi)星核心重復次數(shù)分別是7、8和9次。其中，等位基因407 bp的頻率最高，達到了70.8%，等位基因404、410 bp的頻率分別為16.2%和5.4%。微衛(wèi)星座位Cal-GH02共檢測到6個等位基因，分別為366、375、378、381、384和387 bp，對應的微衛(wèi)星核心重復次數(shù)分別是7、10、11、12、13和14次。其中，等位基因381 bp的頻率最高，達到了70.4%，其次為等位基因384和387 bp，其頻率分別為12.5%和10.0%，

這3個等位基因為優(yōu)勢等位基因，共占92.9%；頻率最小的為375 bp等位基因，僅為0.4%。

微衛(wèi)星座位Cal-GH01中共發(fā)現(xiàn)6種基因型(表3)，其中407/407基因型的頻率最高，達到了61.7%，其次為404/407和404/404基因型，其值分別為13.3%和9.2%。404/410基因型的頻率最低，僅觀察到1次。

微衛(wèi)星座位Cal-GH02中共發(fā)現(xiàn)11種基因型(表3)，其中381/381基因型的頻率最高，達到了50.0%，其次為381/384和381/387基因型，其值分別為19.2%和14.2%。除了表格中列舉的基因型外，366/387和384/384基因型僅觀察到2次，366/378、375/381和387/387基因型僅觀察到1次。

2.3 遺傳多態(tài)性參數(shù)

遺傳特性分析結(jié)果表明：翹嘴鲌GH基因Cal-GH01位點的期望雜合度(He)為0.381 0，觀測雜合度(Ho)為0.207 2，其有效等位基因數(shù)(Ne)為1.611 1，多態(tài)信息含量(PIC)為0.420 (0.250

2.4 二個微衛(wèi)星位點與翹嘴鲌體長和體質(zhì)量的關聯(lián)分析

除去基因型數(shù)目小于3的數(shù)據(jù)后進行單因素方差分析。微衛(wèi)星位點Cal-GH01與體長的分析結(jié)果表明：404/407型個體占樣本數(shù)的13.3%，其體長最長；410/410型個體占樣本數(shù)的2.5%，其體長最短。微衛(wèi)星位點Cal-GH01與體質(zhì)量的分析結(jié)果表明，407/410型個體占樣本數(shù)的微衛(wèi)星位點Cal-GH02中，366/381型個體占樣本數(shù)的3.3%，其體長和體質(zhì)量均表現(xiàn)最大，其體質(zhì)量顯著(P<0.05)大于其他基因型個體。384/387型個體占樣本數(shù)的2.5%，其體長和體質(zhì)量均表現(xiàn)最小，其體長小于其他基因型個體(表3)。

表2翹嘴鲌GH基因側(cè)翼2個微衛(wèi)星位點的等位基因頻率

Table2Allele frequency of two microsatellite loci in flank regions ofCulteralburnusGHgene

Cal-GH01Cal-GH02等位基因Allele/bp重復次數(shù)Number of repeat頻率Frequency/%等位基因Allele/bp重復次數(shù)Number of repeat頻率Frequency/%404716.236672.9407870.8375100.441095.4378112.13811270.43841312.53871410.0

5.0%，其體質(zhì)量最大，410/410型個體同時也是體質(zhì)量較輕的基因型。Cal-GH01不同基因型個體體長和體質(zhì)量均有差異，但差異均不顯著(P>0.05)(表3)。

表3翹嘴鲌微衛(wèi)星位點Cal-GH01和Cal-GH02不同基因型與生長性狀的關聯(lián)分析

Table3Association analysis between growth traits and different genotypes of Cal-GH01 and Cal-GH02 locus inCulteralburnus

位點Locus基因型Genotype頻率Frequency/%體長Body length/cm體質(zhì)量Body weight/gCal-GH01407/40761.717.34±0.34 a63.16±3.91 a404/40713.318.00±0.63 a67.93±6.46 a404/4049.215.63±0.62 a43.52±4.87 a407/4105.015.85±3.13 a73.85±19.71 a410/4102.515.07±0.36 a40.00±3.11 aCal-GH02381/38150.017.36±0.35 ab62.48±3.91 b381/38419.217.17±0.65 ab62.291±7.01 b381/38714.216.96±0.69 ab58.31±6.85 b366/3813.320.15±1.92 a99.93±23.96 a378/3813.315.72±4.98 ab87.43±28.77 b384/3872.515.12±0.83 b43.10±8.13 b

同一位點的同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Data marked without the same lowercase letter in the same column of the same locus indicated significant differences atP<0.05.

3 討論

雖然高通量測序技術發(fā)展迅速，但對于少量特定微衛(wèi)星位點的檢測，仍然需要進行PCR判別條帶大小?，F(xiàn)在較為流行的方法是基于激光檢測系統(tǒng)的熒光標記，但需要用熒光染料標記特異的微衛(wèi)星引物。采用熒光標記進行自動分型雖然方便快捷，但需對每對微衛(wèi)星引物的1條引物進行熒光標記。如果實驗需要采用較多引物的話，實驗成本較高。很多實驗室先用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)及銀染技術在8～12個個體中篩選多態(tài)性微衛(wèi)星引物，再將擴增良好的多態(tài)性引物用熒光修飾。這樣可以節(jié)省成本，但8～12個個體的樣本量較小，有可能漏掉一些多態(tài)性較低的微衛(wèi)星引物，使得對微衛(wèi)星特性的研究存在偏差。而且PAGE費時費力，操作不規(guī)范也可能對實驗人員健康造成影響。Steffens等[19]最早提出采用熒光標記的M13通用引物檢測DNA基因型的方法。隨后，Schuelke[20]通過實驗將這種方法的原理及具體操作流程更細致化，并將這種方法稱之為巢式PCR(nested PCR)。本研究將其應用于翹嘴鲌GH基因側(cè)翼微衛(wèi)星的檢測，取得了良好的效果，表明采用該方法可以較精確地進行微衛(wèi)星分型，值得在水產(chǎn)動物中推廣。

生長激素基因是物種進化中相對保守的基因，近緣物種GH基因的多態(tài)性主要集中在內(nèi)含子中。Almuly等[11，21]發(fā)現(xiàn)金頭鯛GH基因非編碼區(qū)內(nèi)存在小衛(wèi)星和微衛(wèi)星的重復序列，其對于內(nèi)含子1中小衛(wèi)星saGHFIM的研究表明，具有長內(nèi)含子的片段會抑制GH基因表達的活性。雖然在翹嘴鲌內(nèi)含子中未發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星和小衛(wèi)星，但在側(cè)翼發(fā)現(xiàn)了(AAT)8、(CTT)5和(TAA)7微衛(wèi)星序列。本研究發(fā)現(xiàn)的2個微衛(wèi)星位點有其自身的特點：Cal-GH01位點的404、407和410對應的重復次數(shù)分別為7、8和9次，重復次數(shù)均為連續(xù)的，而且重復次數(shù)為8次的占70.8%，推測重復次數(shù)為8的是其原始類型，由于Taq酶的滑動，增加或減少了1個重復而變得具有多態(tài)性。在同屬鯉科的團頭魴(Megalobramaamblycephala)中也發(fā)現(xiàn)了(AAT)11微衛(wèi)星序列，魯雙慶等[22]在鱖屬(Siniperca)3種魚GH第二內(nèi)含子的相同位置均發(fā)現(xiàn)了“AG”微衛(wèi)星序列。因此，在相近物種中，微衛(wèi)星較為保守，可以對該位點在鲌亞科物種分化過程中的變化進行研究。Cal-GH02位點的366、375、378、381、384和387對應的重復次數(shù)分別為7、10、11、12、13和14次。除了重復次數(shù)為7的基因型，其余5種基因型均是連續(xù)的，而且重復次數(shù)為12次的占70.4%，重復13和14次占的比例分別為12.5%和10.0%。推測重復次數(shù)為12的是其原始類型，復制過程中傾向于重復次數(shù)的增加。

黃顙魚的GH基因內(nèi)含子中存在4個微衛(wèi)星位點，且都具有較高的遺傳多樣性；其中，3個位點GA、TCTT和AC都與生長性狀有顯著或極顯著的關聯(lián)性，對于分子育種實踐具有十分重要的意義[5]，本研究沒有得到如此顯著的結(jié)果。魚類的生長是受多個基因調(diào)控的結(jié)果，個體之間GH基因的差別也不只存在于微衛(wèi)星。采用分子標記輔助育種也不會局限于某幾個位點，而是需要科學的數(shù)學模型進行綜合評價。本實驗中同塘養(yǎng)殖的120尾翹嘴鲌生長激素基因側(cè)翼區(qū)微衛(wèi)星位點Cal-GH01中，不同基因型個體體長和體質(zhì)量均有差異，但差異均不顯著(P>0.05)；Cal-GH02中，366/381型個體占樣本數(shù)的3.3%，其體長和體質(zhì)量均表現(xiàn)最大，其體質(zhì)量顯著大于其他基因型個體(P<0.05)，384/387型個體占樣本數(shù)的2.5%，其體長和體質(zhì)量均最小，其體長小于其他基因型個體。這2個微衛(wèi)星位點中優(yōu)勢等位基因所占的比例較高，可在翹嘴鲌不同地理種群或者近緣物種中做進一步研究。