小球藻無菌培養(yǎng)體系的建立及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

武振晉，周廣航，趙奎，王亞君，季春麗, 薛金愛, 李潤植

(山西農(nóng)業(yè)大學 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801)

小球藻無菌培養(yǎng)體系的建立及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

武振晉，周廣航，趙奎，王亞君，季春麗, 薛金愛, 李潤植*

(山西農(nóng)業(yè)大學 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801)

[目的]埃氏小球藻(ErichsenChlorella)富含油脂、具有高效光合固碳能力，是生產(chǎn)生物柴油的優(yōu)質藻種。雜菌污染和培養(yǎng)條件是制約小球藻生物量和油脂產(chǎn)量以及規(guī)模化培養(yǎng)生產(chǎn)的重要因素。為有效防除雜菌污染，優(yōu)化埃氏小球藻培養(yǎng)條件，[方法]本試驗選用5種普通抗生素即頭孢霉素(Cefo)、氨芐霉素(Amp)、羧芐霉素(Car)、硫酸新霉素(Nw)和利福平霉素(Rif)，檢測其不同劑量和組合對埃氏小球藻除菌效果及生長的影響。分析初始接種量、藻液pH、培養(yǎng)溫度和鹽濃度等因子對埃氏小球藻生長的影響。[結果]綜合評定各項指標，建立埃氏小球藻無菌培養(yǎng)體系和優(yōu)化的培養(yǎng)條件。[結論]抗生素組合為Rif+Cefo(30 mL·L-1+100 mL·L-1)；最適培養(yǎng)條件為：接種的初始OD值0.2，pH范圍8.5～9.5，培養(yǎng)溫度(25±0.5) ℃，鹽濃度<0.01 mol·L-1。

埃氏小球藻； 抗生素； 無菌培養(yǎng)體系； 培養(yǎng)條件優(yōu)化

小球藻是可以大規(guī)模養(yǎng)殖的為數(shù)不多的藻種之一，易于培養(yǎng)，生長繁殖快，含有豐富的蛋白質、多糖、維生素、類胡蘿卜素、DHA、EPA等營養(yǎng)物質[1]。小球藻大規(guī)模培養(yǎng)過程中常伴有雜菌污染，并且培養(yǎng)條件的不同對其生長發(fā)育和代謝產(chǎn)物的合成積累影響較大。因此，雜菌防除和培養(yǎng)條件的優(yōu)化是小球藻規(guī)?；囵B(yǎng)的兩個非常重要環(huán)節(jié)。

小球藻細胞壁極易吸附細菌，細菌與小球藻形成共生體系，不易除去[2]。從小球藻的生長曲線上來看，帶菌體系并沒有顯著影響小球藻的生長，但是小球藻的穩(wěn)定期時間卻明顯減少，無菌的小球藻穩(wěn)定期時間是有菌小球藻的4倍左右。穩(wěn)定期是小球藻積累代謝產(chǎn)物的主要時期，如油脂積累就主要在這個時期。高油脂含量是制取生物柴油的前提，所以建立無菌培養(yǎng)體系延長小球藻的穩(wěn)定期，對增加小球藻的油脂積累或其它高附加值天然產(chǎn)物含量非常重要。

在小球藻培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件的不同嚴重影響小球藻的生長以及油脂的積累，例如，在不同鹽濃度、光照強度、pH等條件下，小球藻生長速率有顯著差異。藻液中營養(yǎng)元素含量的不同則導致小球藻細胞體內油脂積累不同。因此，優(yōu)化培養(yǎng)條件可提高小球藻規(guī)?；囵B(yǎng)效率，獲得最佳目標化合物產(chǎn)量[3]。

本試驗選取5種常用抗生素，研究其不同劑量和組合對埃氏小球藻固體和液體培養(yǎng)體系的除菌效果和對小球藻生長等的影響。著重分析了小球藻液體培養(yǎng)中接種濃度、溫度、pH和鹽濃度對埃氏小球藻生物量及生長的影響。通過綜合各種參數(shù)和評定， 建立了埃氏小球藻無菌培養(yǎng)體系和優(yōu)化的培養(yǎng)條件。為該種優(yōu)質小球藻規(guī)模化培養(yǎng)和開發(fā)利用提供了技術和科學參考。

1 材料和方法

1.1 材料

藻種：本試驗所用的埃氏小球藻(ErichsenChlorella)株系SXND-12由山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所從山西省境內分離、鑒定獲得。

抗生素：氨芐霉素(Amp)、羧芐霉素(Car)購自廣州博衍生物科技有限公司。頭孢霉素(Cefo)購自鄭州豫新制藥公司。利福平霉素(Rif)、硫酸新霉素(Nw)購自Invitrogen公司。所有抗生素均是粉末，母液的配制參照錢文倩的方法[4]，并用0.22 μm濾膜過濾除菌。

培養(yǎng)基：BG11液體和固體培養(yǎng)基按照表1配制，用1 mol·L-1的鹽酸和氫氧化鈉將液體培養(yǎng)基的pH調至6.5左右，高壓滅菌20 min，溫度為121 ℃。滅菌前固體培養(yǎng)基中添加1.2%的瓊脂。試驗中按照要求分別加入抗生素。

2216E固體培養(yǎng)基[5]成分見表2：調節(jié)pH到7.4～7.8。

表1 BG11培養(yǎng)基(母液)配方

表2 2216E培養(yǎng)基配方

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

接種物的制備：在平板上挑取體積較大，生長狀態(tài)良好的埃氏小球藻藻落，利用接種針將其接種于含有一定量新鮮培養(yǎng)液的三角燒瓶中，一周后轉接到體積為250 mL三角燒瓶進行擴大培養(yǎng)，生長至指數(shù)期離心，轉速為6 000 r·min-1，時間 5 min，倒掉上清液，無菌水洗滌2～3次，用一定量新鮮的滅菌的培養(yǎng)液懸浮，用于接種。

液體培養(yǎng)：將懸浮液轉接到含有一定量培養(yǎng)液的100 mL的三角燒瓶中，利用紗布將瓶口包裹若干層，防止細菌侵入。設置培養(yǎng)條件為光照強度 5 000 lx，濕度控制在50%，溫度控制在(25+0.5)℃，光暗比12∶12，PH 8.5。

固體培養(yǎng)：取一定量對數(shù)期的藻液，精確稀釋至合適濃度，取100 μL涂布于BG11固體平板上，設置培養(yǎng)條件為光照強度 5 000 lx，濕度控制在50%，溫度控制在(25+0.5) ℃。

1.2.2 5種抗生素及組合除菌效果及對埃氏小球藻生長影響的檢測

小球藻敏感性檢測：通過液體培養(yǎng)試驗進行小球藻對抗生素敏感性的深入研究，Amp，Car，Nw，Cefo4種抗生素試驗梯度分別設置為0、100、200、300、400、500 mg·L-1；利福平的試驗梯度設置為0、10、30、70、100 mg·L-1。取一定量的對數(shù)生長期末期的小球藻藻液加入100 mL的三角燒瓶中，并加入相應的抗生素，封口防止空氣中的細菌進入。設置培養(yǎng)條件：光照強度3 500 lx，光暗比12∶12 h，溫度25 ℃，pH 8.5，每天固定時間測小球藻的生長量。

細菌敏感性檢測：取少許生長至穩(wěn)定期的藻液，精確稀釋到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6倍，取100 μL涂布于固體的2216E平板上，在溫度為23 ℃的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)10 d，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)獲得此條件下細菌的最佳稀釋梯度。取少許生長至穩(wěn)定期的藻液，按最佳稀釋度稀釋，取100 μL涂布于固體的2216E平板上。將直徑為5.5 mm的已滅菌的濾紙，在不同抗生素濃度下，至少浸泡20 s，將其貼在固體平板的中心位置，3 d后測量抑菌圈的大小。

混合抗生素除菌檢測：挑取固體平板上生長狀態(tài)良好的單菌落進行液體培養(yǎng)，獲得不含霉菌的藻液用于后續(xù)試驗。根據(jù)試驗結果，選擇合適的抗生素，根據(jù)各種抗生素的不同特性，設計抗生素的組合方式及試驗濃度。按設計要求將各種抗生素加到處于對數(shù)生長期末期的三角燒瓶中，2 d后取適量的藻液稀釋后涂布于2216E固體平板上檢測細菌，每隔3 d按相同的劑量在藻液中追加抗生素，培養(yǎng)2 d后再涂布于2216E固體平板上檢測細菌。重復加3次抗生素，在2216E固體平板上初步檢測除菌效果。

根據(jù)抗生素的抑菌原理，設計組合方式：(1)Amp，Car，Cefo(2)Rif，Cefo。并且以不同的濃度進行組合。

無菌體系的檢測：對初步鑒定為無菌體系的藻株進行傳代培養(yǎng)，完全消除抗生素的影響后采用LB，2216E，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行細菌的最終檢測，培養(yǎng)基配方見表3。

無菌體系下小球藻生長狀況檢測：將無菌的小球藻和含菌的小球藻按初始OD值0.2的接種量進行接種，置于光照培養(yǎng)箱內，溫度25 ℃，光照強度設置為3 500 lx，光暗時間比設置成12 h∶12 h，藻液的pH 值控制在8.5左右培養(yǎng)，每天定時測藻液的生長量，觀察小球藻的生長狀況及每個生長階段的變化。

1.2.3 無菌體系下培養(yǎng)條件的優(yōu)化

將無菌的小球藻按初始OD值0.2的接種量進行接種，置于光照培養(yǎng)箱內，溫度25 ℃，光照強度設置為3 500 lx，光暗時間比設置成12 h∶12 h，初始pH 8.5，每天定時測藻液的pH(每天早晚測一次，相隔12 h)，監(jiān)測pH變化。在此條件下分別研究pH、接種量、培養(yǎng)溫度、鹽濃度對埃氏小球藻生長的影響。其中pH梯度設置為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，培養(yǎng)過程中使用1 mol·L-1酸堿調節(jié)；接種初始OD設置為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25；溫度梯度設置為10、17、25、32、40 ℃；鹽濃度梯度設置為0.01、0.05、0.1、0.2、0.4 mol·L-1，各組試驗每天定時測藻液的生長量。

2 結果與討論

2.1 液體培養(yǎng)條件下埃氏小球藻對5種抗生素敏感性

試驗結果顯示，在所設劑量范圍內，Amp、Car、Cefo、Nw對固體培養(yǎng)基上埃氏小球藻的正常生長基本沒有受到影響。如圖1所示，在試驗濃度范圍內液體培養(yǎng)條件下4種抗生素基本不影響小球藻的生長。圖2是在小球藻在加入不同濃度Rif下培養(yǎng)10 d后的結果，藻液顏色鮮綠，顯微鏡下微藻細胞結構完整，對藻體的生長沒有明顯的影響。這與固體培養(yǎng)時的試驗結果稍有差異(固體培養(yǎng)時100 mg·L-1濃度致死率為53.75%)?？赡茉虬ǎ阂后w中藻細胞能更好的利用溶解在水中的二氧化碳進行光合作用，并且此次試驗選取的是小球藻生長穩(wěn)定期的藻液，藻液中有大量的代謝產(chǎn)物，其中的某些成分可能中和了抗生素的作用，使其藥效降低。

表3 LB和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方

Table 3 Medium composition of LB and Beef extract peptone

試劑Reagent工作液/g·L-1WorkingfluidLB培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基胰蛋白胨10酵母提取物5氯化鈉10瓊脂粉150蛋白胨10牛肉膏3氯化鈉5瓊脂粉15

試驗結果表明這5種抗生素在實驗濃度范圍內并未對小球藻的生長造成影響，可直接進行無菌培養(yǎng)體系的研究，無需再考慮其對小球藻生長上的影響。

圖1 四種抗生素(A)氨芐霉素，(B)頭孢霉素，(C)羧芐霉素和(D)硫酸新霉素對埃氏小球藻生長的影響Fig.1 Effect of four kinds of antibiotics(A) Ampicillin, (B) Cephalosporins, (C) Carbenicillin and (D) Neomycin sulfateon on Erichsen Chlorella growth

圖2 不同濃度利福平對埃氏小球藻生長的影響Fig.2 Effect of Rifampicinon concentration on Erichsen Chlorella growth

2.2 藻液中細菌對抗生素的敏感性

通常認為抑菌直徑超過20 mm表明抗生素對這種菌具有良好的抑制作用[5]，通過藥敏試劑法[6]得到Cefo、Amp、Car、Nw、Rif在相應濃度下的抑菌直徑，結果見表4。硫酸新霉素沒有較好的抑菌能力，而利福平霉素卻表現(xiàn)出極強的抑菌特性，形成了明顯的3個透明圈。最里面的透明圈完全無菌，外面兩個透明圈菌落較多，種類不一?？赡茉谳^低濃度時只抑制某些細菌的生長。另外羧卞霉素，氨芐霉素對某些細菌的抑制效果較好，考慮到細菌對藥物的耐受性及整體的除菌效果，本試驗選擇多種抗生素混合使用以求達到更好的抑菌效果[7]。

表4 不同抗生素在相應濃度下抑菌直徑

Table 4 Suppress diameter of different antibiotics on bacteria

抗生素Antibiotics最大抑菌直徑/mmMaximumsuppressdiameter最小抑菌直徑/mmMinimumsuppressdiameter是否抑制所有菌Suppressallstrains利福平55122124一定條件下可行頭孢霉素40010否羧卞霉素18340否氨芐霉素20110否硫酸新霉素5280否

2.3 埃氏小球藻無菌體系的建立

在埃氏小球藻生長過程中會伴隨著多種菌的存在，比如透明的水泡狀菌株，乳白色、黃色、橘紅色、土黃色的細菌菌株，還有一些性狀不規(guī)則的細菌等。這些細菌一部分對埃氏小球藻的生長有利，一部分則是埃氏小球藻的競爭者，一旦競爭性強的細菌在生長過程中占據(jù)優(yōu)勢，就會嚴重抑制培養(yǎng)液中埃氏小球藻的生長[9]。

氨芐霉素，羧卞霉素，頭孢霉素，利福平等抗生素具有殺菌作用，而且抗生素殺菌原理之一就是選擇性毒理[8]。選擇適宜的抗生素可以在不影響微藻生長的基礎上選擇性地抑制或殺死細菌，是一種比較理想的除菌方法[9]。本試驗將幾種抗菌譜不同的抗生素組合[10～14]，建立埃氏小球藻無菌體系。

表5為第一種混合方式(Amp+Car+Cefo)，如果只用抗生素處理一次，均不能達到完全除菌的效果，追加一次抗生素處理后，B5濃度下，小球藻生長處于無菌狀態(tài)。將此小球藻嚴格無菌操作轉接5次左右，完全消除抗生素的影響。然后，用固體平板培養(yǎng)的方法在2216E、LB、牛肉膏蛋白胨等培養(yǎng)基來檢測除菌效果，經(jīng)對比分析，確認B5組合處理方式可得到良好的無菌藻株。

表5 第一種混合方式(Amp+Car+Cefo)的除菌效果

注：B0：無抗生素對照; B1：200+200+50; B2：400+400+100; B3：600+600+150; B4：1 000+1 000+300; B5：2 000+2 000+500/mg·L-1

Note：B0:No antibiotics against B1:200+200+50; B2：400+400+100; B3：600+600+150; B4：1 000+1 000+300; B5：2 000+2 000+500/mg·L-1

表6第二種混合方式(Rif+Cefo)具有良好的除菌效果，用相應的抗生素處理一次，A4，A5這兩個濃度下初步判定無細菌存在。用抗生素追加處理一次除菌效果更加明顯。在所設置的試驗濃度下，將藻液涂布于2216E平板上無細菌出現(xiàn)。將其進行若干次繼代培養(yǎng)，完全消除抗生素的影響。然后在2216E，LB，以及牛肉膏蛋白胨等固體培養(yǎng)基上進行細菌檢測，確認A2～A5這4種劑量的組合處理兩次均可獲得埃氏小球藻的無菌體系?？紤]到細菌會逐漸對抗生素產(chǎn)生抗性及過多使用抗生素的危害，所以本試驗選取A2組合，處理兩次作為建立無菌體系的最佳途徑。

表6 第二種混合方式(Rif+Cefo)的除菌效果

注：A0：無抗生素對照 A1：10+50; A2：30+100; A3：50+150; A4：70+200; A5：100+300/mg·L-1

Note：A0:No antibiotics against A1：10+50; A2：30+100; A3：50+150; A4：70+200; A5：100+300/mg·L-1

2.4 無菌體系對埃氏小球藻生長的影響

將獲得的完全無菌的埃氏小球藻和帶菌的埃氏小球藻置于完全相同的條件下進行培養(yǎng)，小球藻生長曲線如圖3所示。從生長趨勢來看微藻可以和細菌共存，兩種狀態(tài)下藻液的最終細胞密度基本一致。

圖3 細菌對小球藻生長的影響Fig.3 Effect of bacteria on Chlorella growth

達到穩(wěn)定期之后,圖4所示無菌的埃氏小球藻穩(wěn)定期20 d后搖動培養(yǎng)瓶，觀察到無菌體系的微藻能長期保持鮮綠的顏色，其穩(wěn)定期時間能達到有

菌培養(yǎng)時小球藻的3～5倍，并且沒有聚沉的現(xiàn)象。而雜菌較多時小球藻2周就可能出現(xiàn)聚沉現(xiàn)象。這可能是由于細菌的存在分泌了某些粘性物質，使微藻附著在一起，光合作用降低，產(chǎn)生的有機物減少，造成呼吸作用不順，產(chǎn)生大量代謝廢物，從而導致其生存環(huán)境的惡化[15]。

2.5 不同培養(yǎng)條件因子對埃氏小球藻生長的影響

2.5.1 pH對埃氏小球藻生長的影響

由圖5(A)可知，小球藻適宜的pH生長范圍在5.5～9.5之間，酸度較大不利于小球藻的生長，pH值低至4.5時藻細胞的生長受到很大的影響，生物量極小，尤其是當pH值小于3.5時藻細胞幾乎不再生長。pH值過大對藻細胞的正常生長也極為不利，若pH達到11，藻液中大量的OH-離子會與藻液中的Ca2+形成大量沉淀，造成營養(yǎng)成分的缺失，影響藻細胞的生長。

本試驗得出藻細胞對pH值的承受范圍是7.5～9.5。而平時配制培養(yǎng)基進行批量培養(yǎng)時并不需要滅菌處理，這時培養(yǎng)基的pH值大多處在8.0～8.5，完全處在小球藻生長的最佳pH范圍，因此大批量培養(yǎng)時并不需要對培養(yǎng)液的pH值進行調節(jié)。從小球藻生長過程中pH的變化來看，最大pH能達到10左右，并最終穩(wěn)定在堿性環(huán)境中生存。這主要是由于藻液中的NO3-和 HCO3-共同作用的結果：藻細胞吸收NO3-時導致H+發(fā)生共轉運，藻液pH上升；另一方面由于HCO3-的不斷消耗使緩沖體系不斷向堿性漂移[5]。最終微藻穩(wěn)定在堿性環(huán)境中生存下來，這時藻液的pH值可能達到10左右，但并不會抑制其生長，所以大規(guī)模的培養(yǎng)過程中并不需要刻意的調節(jié)pH值。

圖4 不同條件下(A無菌狀態(tài)，B有菌狀態(tài))埃氏小球藻穩(wěn)定期生長狀態(tài)Fig.4 Growth state of Erichsen Chlorella at stable stage under different (A sterile, B unsterile) conditions

圖5 不同培養(yǎng)條件(A) pH、(B)接種量、(C)溫度、(D)鹽濃度對埃氏小球藻生長的影響Fig.5 Effect of different culture conditions by (A) pH,(B) inoculum dose,(C) temperture,(D) salt concentration on Chlorella Growth

2.5.2 接種量對小球藻生長的影響

由圖5(B)可知，當小球藻接種的初始OD值達0.1或以上時，小球藻的生長趨勢幾乎一致，當小球藻接種的初始OD值為0.05時小球藻的相對生長速率明顯降低。在大規(guī)模的培養(yǎng)中，接種量對微藻的生長影響較為明顯，以本實驗室1 000 L的立式光反應器為例，若接種量過低，在生長初期細菌為優(yōu)勢生長種群，細菌的大量繁殖會造成培養(yǎng)液成分的大量損失，另一方面還可能會導致對微藻生長有害的菌類的大量生長，造成微藻的死亡，對生產(chǎn)造成巨大的損失；若接種量過大，一方面會增加成本和工作量，另一方面還會帶來舊培養(yǎng)液中大量的代謝物及病原菌，對微藻的生長不利[16]，因此合適接種量的選擇在大規(guī)模生產(chǎn)中非常重要。本實驗的研究結果得出接種時OD值為0.15～0.20最佳，綜合考慮大規(guī)模培養(yǎng)時細菌的影響，選擇小球藻接種的初始OD為0.20是較為理想的接種量。

2.5.3 溫度對埃氏小球藻生長的影響

由圖5(C)可知，小球藻適宜的生長溫度在17～32 ℃，溫度過高或過低均不利于小球藻的生長；當溫度低至10 ℃時，小球藻的生長受到抑制，生長緩慢，但是將其轉移到合適的溫度時小球藻在短時間內就可以恢復生長，說明低溫有延緩其生長的作用。當溫度高至40 ℃時，小球藻很快發(fā)黃，生長滯緩，將其轉移至合適的溫度下，也不能恢復生長，說明高溫將小球藻全部致死。

17～32 ℃ 是小球藻可正常生長的溫度范圍，17 ℃時，小球藻的最終生長密度沒有降低，但是它的生長速率卻比較緩慢。25 ℃和32 ℃時，小球藻的生長速率及最終的生長密度基本一致，但溫度過高時，藻液蒸發(fā)較快，造成有效營養(yǎng)成分的含量發(fā)生變化，對微藻藻細胞的生長不利，所以25 ℃是小球藻生長的最佳溫度。

2.5.4 鹽濃度對埃氏小球藻生長的影響

由圖5(D)和圖6可見，鹽濃度對藻細胞的生長影響較大，鹽濃度過大時,小球藻藻液顏色發(fā)黃，生長滯緩。培養(yǎng)液中鈉鹽的濃度為0.05 mol·L-1時，藻細胞的生長被嚴重抑制，顯微鏡下觀察到細胞顏色發(fā)黃，當培養(yǎng)液中鈉鹽的濃度達到0.2 mol·L-1及以上時，藻細胞幾乎完全停止生長，絕大多數(shù)細胞的細胞膜和細胞壁發(fā)生破裂，大量內容物流出。其可能原因為隨著鹽濃度的升高，細胞外液滲透壓越來越大，致使藻細胞大量吸水膨脹，最終導致細胞破裂大量內容物流出。

圖6 鹽濃度對小球藻生長的影響Fig.6 Effect of salt concentration on Chlorella growth

3 結論

通過本試驗研究發(fā)現(xiàn)，氨芐霉素，羧卞霉素，頭孢霉素，利福平均對埃氏小球藻培養(yǎng)液中的細菌有一定的抑制作用，但對小球藻的生長影響不大，可用作埃氏小球藻除菌試劑。利用涂板法除去埃氏小球藻中霉菌，抗生素組合使用A2(Rif+Cefo)(30+100)(單位mg·L-1)，處理兩次，除菌效果良好，以此建立埃氏小球藻無菌培養(yǎng)體系。其中，組合抗生素的應用可避免雜菌耐藥性的問題。在此無菌培養(yǎng)體系下，通過不同培養(yǎng)條件的實驗研究，確定在pH 8.5～9.5，接種初始OD值0.2，溫度(25±0.5)℃，鹽濃度小于0.01 mol·L-1時，埃氏小球藻生長狀況良好，該條件即埃氏小球藻最佳生長條件。

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[15]楊世平,劉慧玲,李活,等.兩種微藻在無菌和帶菌狀態(tài)下生長特點比較研究[J].漁業(yè)現(xiàn)代化,2009,36(5):45-49.

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(編輯：馬榮博)

The establishment of sterile culture system and optimization of culture conditions fromErichsenchlorella

Wu Zhenjin, Zhou Guanghang, Zhao Kui,Wang Yajun,Ji Chunli, Xue Jinai, Li Runzhi*

(InstituteofMolecularAgriculture&Bioenergy,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801，China)

[Objective]ErichsenChlorellais a promising candidate for biofuel production for its high lipid content and photosynthetic efficiency. However, contamination and cultivation conditions controlling are two important factors affecting the microalgal biomass and lipid accumulation, as well as the large scale production ofChlorella. [Method]In this study, 5 antibiotics cefazolin and Cephalosporins(Cefo), Ampicillin(Amp), Carbenicillin(Car), Neomycin sulfateon(Nw) and rifampicin and amphotericin (Rif) were tested as bacteriostat with different concentrations and combinations, the effect of the antibiotics on the bacteria inhibition and microalgal growth were explored. In addition, the effects of inoculum, medium culture pH, cultivation temperature and salt concentration in culture medium onChlorellagrowth were also studied. [Results]As a result, a sterile system forChlorellacultivation was established and the cultivation conditions were optimized then. [Conclusion]Results showed that the combination of 30 mL·L-1Rif and 100 mL·L-1Cefo was effectively bacteriostatic in the cultivation system ofChlorella. And the optimal conditions forChlorellagrowth were as follows: OD 0.2 for initial inoculum, pH range 8.5-9.5, cultivation temperature(25±0.5) ℃ and salt density lower than 0.01 mol·L-1.

ErichsenChlorella, Antibiotics, Sterile system, Optimization of cultivation conditions

2016-11-12

2016-12-14

武振晉(1992-)，男(漢)，山西汾陽人，碩士研究生，研究方向：生物能源代謝工程

*通信作者：李潤植，教授，博士生導師，Tel:0354-6288374; E-mail:rli2001@hotmail.com

國家“948”項目(2014-Z39)；山西省煤基重點科技攻關項目(FT-2014-01)

Q93-335

A

1671-8151(2017)04-0287-08