巨噬細(xì)胞浸潤在低級別膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測中的研究

馬健行 吳鵬飛 楊偉 廖茂君 易良 許民輝

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。膠質(zhì)瘤可根據(jù)WHO組織病理學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ～Ⅳ級；在成人中以WHOⅡ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤最常見，且腫瘤級別越高，患者預(yù)后越差[2]。低級別膠質(zhì)瘤（low grade glioma，LGG）具有侵襲性生長、放化療抵抗等惡性生物學(xué)特征，并且有向高級別膠質(zhì)瘤進(jìn)展的傾向，傳統(tǒng)治療方法包括手術(shù)全切腫瘤、術(shù)后輔以放療、化療在內(nèi)的綜合治療，患者預(yù)后仍不理想。

異檸檬酸脫氫酶1和2（isocitrate dehydrogenase 1 and 2，IDH1 and IDH2）是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，腫瘤細(xì)胞中IDH 1/2基因突變使2-羥戊二酸大量堆積[3]，抑制組蛋白和DNA去甲基化酶，誘導(dǎo)組蛋白和DNA超甲基化，通過表觀遺傳修飾途徑誘導(dǎo)細(xì)胞分化阻滯[4]。IDH突變絕大部分發(fā)生于IDH 1基因，另有不到1%發(fā)生在IDH 2基因[5]。研究表明，腫瘤細(xì)胞IDH 1/2基因的突變狀態(tài)是LGG分子分型的重要參考指標(biāo)，IDH 1/2突變型低級別膠質(zhì)瘤（IDH 1/2-mu LGG）患者預(yù)后好于IDH 1/2野生型低級別膠質(zhì)瘤（IDH 1/2-wt LGG）患者[6]。

膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過分泌多種因子吸引免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織，這些免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和趨化因子，與腫瘤細(xì)胞相互作用，形成膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境[7]。腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages，TAM）是膠質(zhì)瘤免疫抑制微環(huán)境重要的組成成分[8]，除表達(dá)巨噬細(xì)胞標(biāo)記物（CD68、CD11b、IBA1）外，TAM 還具有 CD163、CD204等多種標(biāo)記物特異表達(dá)的特點[7]；膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌趨化因子 CCL2[9]、CCL5[10]、骨膜蛋白（POSTN）[11]、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[12]和神經(jīng)降壓素（Neurotensin）[13]誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和TAM浸潤，TAM分泌免疫抑制因子如白介素 -10（IL-10）[14]、轉(zhuǎn)化生長因子 -β（TGF-β）[15]，形成腫瘤免疫抑制微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲。

相關(guān)研究提示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞IDH 1/2突變狀態(tài)影響膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境構(gòu)建[16]，但其對TAM浸潤程度和功能狀態(tài)有何影響以及TAM浸潤相關(guān)指標(biāo)在LGG各分子亞型預(yù)后預(yù)測的價值尚不明確。因此，本研究通過檢測膠質(zhì)瘤石蠟樣本和分析癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）中LGG數(shù)據(jù)，揭示TAM特異標(biāo)志物、相關(guān)趨化因子和免疫抑制因子在IDH 1/2-wt LGG和IDH 1/2-mu LGG中的表達(dá)差異，闡明TAM浸潤相關(guān)指標(biāo)在IDH 1/2-wt LGG和IDH 1/2-mu LGG患者預(yù)后預(yù)測中的價值。

材料與方法

一、材料

1.腫瘤石蠟標(biāo)本：收集2017年1月至2017年10月陸軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)外科行手術(shù)治療的低級別膠質(zhì)瘤患者的腫瘤石蠟標(biāo)本共36例（包括17例IDH 1/2-wt LGG和19例IDH 1/2-mu LGG）。所選病例病理信息完整，患者已簽署知情同意書。

2. TCGA數(shù)據(jù)：本實驗所需的529例LGG（包括419例IDH 1/2-mu LGG和110例IDH 1/2-wt LGG）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、單核苷酸突變數(shù)據(jù)和臨床信息數(shù)據(jù)下載自TCGA數(shù)據(jù)庫[17]。

3.試劑：小鼠抗人單克隆抗體CD68（kit- 0026）購自福州邁新公司，小鼠抗人單克隆抗體CD163（ZM-0428）、小鼠抗人單克隆抗體CD204（TA802777）購自中杉金橋公司；DAB顯色試劑購自福州邁新公司，其余試劑即配即用。

二、實驗方法

1.免疫組織化學(xué)染色：將上述膠質(zhì)瘤患者的腫瘤石蠟標(biāo)本切片置于60 ℃溫箱4 h脫蠟、水合，然后封閉內(nèi)源性過氧化物酶，熱抗原修復(fù)。用免疫組化筆畫圈圍住組織，圓圈完整。滴加一抗工作液（CD68、CD163、CD204）蓋住組織，然后放入濕盒內(nèi)4 ℃過夜。12 h后，取出濕盒，37 ℃復(fù)溫30 min，滴加DAB顯色，然后用蘇木素復(fù)染顯色細(xì)胞核，脫水，晾干片子后滴加適量中性樹膠封片，蓋上蓋玻片，小心氣泡，晾干即可。用非免疫血清代替一抗工作液作為陰性對照。

2.數(shù)據(jù)處理：免疫組化陽性染色區(qū)域的平均光密度值（average optical density，AOD）使用Image Pro Plus 6.0分析；TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，將數(shù)據(jù)格式由FPKM轉(zhuǎn)換為TPM；基因表達(dá)水平高低的截斷值使用Cut-off Finder[18]計算。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各指標(biāo)表達(dá)水平非正態(tài)分布，統(tǒng)計方法使用Mann- WhitneyU檢驗；上述分子表達(dá)水平對IDH 1/2-mu LGG和IDH 1/2-wt LGG預(yù)后的影響使用COX回歸分析進(jìn)行評價；兩組患者生存分析使用Kaplan- Meier法，兩組間生存率的比較使用對數(shù)秩檢驗（log-rank test），以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、巨噬細(xì)胞和TAM分子標(biāo)志物表達(dá)水平存在差異

TCGA中529例LGG數(shù)據(jù)分析顯示，巨噬細(xì) 胞 標(biāo) 志 物 CD68（Mann-WhitneyU= 19425，P＜0.05）、CD11b（Mann-WhitneyU=15836，P＜0.01）、IBA1（Mann-WhitneyU=17758，P＜0.01）表 達(dá) 水 平 在 IDH1/2-wt LGG 中 升 高；TAM 標(biāo) 志 物 CD163（Mann-WhitneyU=18112，P＜0.01）、CD204（Mann-WhitneyU=12676，P＜0.01）的表達(dá)水平也在IDH1/2-wt LGG中升高（圖 1，表 1）。

圖1 巨噬細(xì)胞和TAM標(biāo)記物在IDH1/2-wt LGG和IDH1/2-mu LGG中的表達(dá)水平

二、免疫組化檢測TAM在IDH 1/2-wt和IDH 1/2-mu LGG中的浸潤程度

免疫組織化學(xué)染色顯示，IDH 1/2-wt LGG中CD68+細(xì)胞、CD163+和CD204+細(xì)胞浸潤數(shù)量高于 IDH 1/2-mu LGG；CD68、CD163、CD204 在IDH 1/2-wt LGG組織中的表達(dá)數(shù)量和強(qiáng)度均高于IDH 1/2-mu LGG。CD68、CD163、CD204陽 性 染色位于部分細(xì)胞漿中，呈棕褐色；IDH 1/2-wt LGG組織切片CD68、CD163、CD204染色強(qiáng)度均較IDH 1/2-mu LGG切片染色深，且IDH 1/2-wt LGG切片中陽性染色細(xì)胞的比例也高于IDH 1/2- mu LGG。兩組樣本陽性染色區(qū)域AOD值分析顯示，IDH 1/2-wt LGG 中 CD68（Mann-WhitneyU= 51，P＜ 0.01）、CD163（Mann-WhitneyU= 35，P＜ 0.01）、CD204（Mann-WhitneyU= 20，P＜ 0.01）表達(dá)水平較 IDH 1/2-mu LGG 均升高（P＜ 0.01）（圖 2 ～ 3，表 2）。

表1 Mann-Whitney U檢驗IDH1/2-wt和IDH1/2-mu LGG中巨噬細(xì)胞和TAM標(biāo)志物表達(dá)

表2 Mann-Whitney U檢驗免疫組化中CD68、CD163和CD204的表達(dá)

圖2 光學(xué)顯微鏡下觀察CD68、CD163和CD204在組織中的表達(dá)情況（DAB染色，×400）

圖3 CD68、CD163和CD204在腫瘤組織切片中的表達(dá)

三、TAM趨化因子和免疫抑制因子表達(dá)水平存在差異

TCGA中529例LGG數(shù)據(jù)分析顯示，在IDH 1/2-wt LGG組中TAM趨化因子CCL2（Mann- WhitneyU= 15 841，P＜ 0.01）、CCL5（Mann- WhitneyU= 11 326，P＜ 0.01）、POSTN（Mann- WhitneyU= 8 893，P＜ 0.01）、VEGF-A（Mann- WhitneyU= 14 433，P＜ 0.01）、Neurotensin（Mann- WhitneyU= 15 556，P＜ 0.01）的表達(dá)水平均較IDH 1/2-mu LGG升高。同時，TAM產(chǎn)生的免疫抑制因子TGF-β（Mann-WhitneyU= 15 459，P＜ 0.01） 和 IL-10（Mann-WhitneyU= 17 334，P＜ 0.01）的表達(dá)水平在IDH 1/2-wt LGG組中也升高（圖 4，表 3）。

四、CD163和IL-10的表達(dá)水平分別與IDH 1/2-wt和IDH 1/2-mu LGG患者的預(yù)后負(fù)相關(guān)

TCGA數(shù)據(jù)Kaplan-Meier生存分析顯示，CD163表達(dá)水平與IDH 1/2-wt LGG患者預(yù)后負(fù)相 關(guān)（P= 0.0125），CD163lowIDH 1/2-wt LGG 組和 CD163highIDH 1/2-wt LGG組的 2年和 5年總生存率分別為69.7%vs45.3%和 40.6%vs18.6%，但該分子表達(dá)水平與IDH 1/2-mu LGG患者預(yù)后無相關(guān)性（P= 0.3926）。IL-10表達(dá)水平與IDH 1/2- mu LGG 患者預(yù)后負(fù)相關(guān)（P= 0.0259），IL-10lowIDH 1/2- mu LGG組和 IL- 10highIDH1/2-mu LGG組的5年總生存率分別為75.9%vs50.5%，但該分子表達(dá)水平與IDH 1/2-wt LGG患者預(yù)后無相關(guān)性（P= 0.0721）。（圖 5）

討 論

膠質(zhì)瘤中的巨噬細(xì)胞在不同的信號刺激下，可以激活成兩種不同的免疫表型：促進(jìn)炎癥發(fā)生的經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞和抑制炎癥反應(yīng)的替代性活化巨噬細(xì)胞，腫瘤中巨噬細(xì)胞以后者浸潤為主，即TAM[19]。TAM與其他細(xì)胞共同形成免疫抑制微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤生長。本研究發(fā)現(xiàn)IDH 1/2-mu LGG中巨噬細(xì)胞和TAM浸潤數(shù)量較IDH 1/2-wt LGG明顯減少，且IDH 1/2-mu LGG腫瘤微環(huán)境中TAM趨化因子和免疫抑制因子表達(dá)水平較IDH 1/2-wt LGG也明顯降低。TAM標(biāo)志物CD163及其分泌的免疫抑制因子IL-10表達(dá)水平分別與IDH 1/2-wt LGG和IDH 1/2-mu LGG患者總生存率負(fù)相關(guān)。

圖4 TAM趨化因子、免疫抑制因子在IDH1/2-wt LGG和IDH1/2-mu LGG中的表達(dá)水平

表3 Mann-Whitney U檢驗TAM趨化因子和免疫抑制因子表達(dá)

圖5 CD163和IL10表達(dá)水平對IDH-wt/mu LGG患者總生存期的影響

膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生多種趨化因子促進(jìn)TAM浸潤。膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以直接分泌CCL2和CCL5，也可以通過分泌Neurotensin與TAM上的NTR3/ sortilin受體結(jié)合，刺激TAM合成分泌大量的CCL2和CCL5[13]。CCL2是最重要的招募TAM的趨化因子之一，CCL2與TAM表達(dá)的受體CCR2相結(jié)合，通過CCL2-CCR2-IL-6信號通路促進(jìn)新生血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，CCL2的表達(dá)水平與腫瘤病理級別正相關(guān)[9]。CCL5與TAM上的受體CCR1/ CCR5結(jié)合，通過冗余方式招募TAM[20]。膠質(zhì)瘤中POSTN表達(dá)水平與腫瘤病理級別正相關(guān)，與患者的預(yù)后負(fù)相關(guān)。缺氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤中POSTN表達(dá)上調(diào)，引起巨噬細(xì)胞大量浸潤并促進(jìn)其向TAM表型轉(zhuǎn)化[21]。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，POSTN表達(dá)水平與TAM浸潤程度正相關(guān)，干擾POSTN的表達(dá)可以減少TAM的浸潤，抑制腫瘤生長，延長載瘤小鼠的生存時間[11]。多項研究表明，TAM分泌大量的VEGF促進(jìn)腫瘤血管形成，因此，Piao等在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型中聯(lián)合應(yīng)用貝伐單抗與舒尼替尼，分別阻斷VEGF和VEGF受體（VEGFR），抑制腫瘤的血管形成，減少骨髓來源的巨噬細(xì)胞浸潤，延長載瘤小鼠生存時間[22]。在脈絡(luò)膜新生血管性疾病模型中，阻滯VEGFR同樣可以觀察到巨噬細(xì)胞浸潤的減少[23]。本研究提示，IDH1/2-mu LGG組中TAM趨化因子表達(dá)水平低可能是IDH1/2-mu LGG患者預(yù)后較好的因素之一。

TAM浸潤能夠降低LGG總生存率。腫瘤細(xì)胞通過分泌TAM趨化因子招募巨噬細(xì)胞并促進(jìn)其向免疫抑制表型TAM轉(zhuǎn)化。TAM除了具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的功能外，還可以分泌蛋白聚糖，抗胰蛋白酶，穿透素-3和多種金屬蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)新生血管生成[24-25]；有研究表明，TAM甚至可以通過分泌喹啉酸，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤對DNA損傷的修復(fù)能力，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤對放化療耐受[26]。研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和TAM浸潤數(shù)量與腫瘤的病理惡性程度相關(guān)[27]；在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，短生存期（OS ＜ 36個月）膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TAM所占的比例高于長生存期（OS ＞ 36個月）的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[28]。由于IDH 1/2-mu LGG患者具有更好的放化療敏感性，IDH 1/2-mu LGG患者往往較IDH 1/2- wt LGG患者具有更好的預(yù)后。本研究進(jìn)一步提示，IDH 1/2-mu LGG患者免疫微環(huán)境中TAM浸潤數(shù)量少也可能是該類患者具有較好預(yù)后的原因之一。

TAM通過分泌大量免疫抑制因子和免疫細(xì)胞間的相互作用形成膠質(zhì)瘤免疫抑制微環(huán)境。TAM同時表達(dá)IL-10和IL-10受體，通過自分泌模式維持TAM免疫表型；IL-10的自分泌引起轉(zhuǎn)錄因子STAT3磷酸化，誘導(dǎo)TGF-β的轉(zhuǎn)錄[7]。研究表明，TGF-β可以引起TAM的標(biāo)記物CD163、CD204表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)向巨噬細(xì)胞向TAM轉(zhuǎn)化[27]。此外，TGF-β和IL-10還可以降低T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的抗腫瘤能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、和遷移[19,29]。本研究表明，在IDH 1/2-mu LGG中，免疫抑制因子IL-10和TGF-β表達(dá)水平較IDH1/2- wt LGG降低、免疫抑制狀態(tài)較弱，降低腫瘤增殖、遷移能力。因此TAM分泌的免疫抑制因子水平較低可能是IDH 1/2-mu LGG預(yù)后較好的因素之一。與IDH 1/2-wt LGG相比，IDH 1/2-mu LGG表達(dá)的TAM趨化因子減少，腫瘤中巨噬細(xì)胞和TAM浸潤的數(shù)量和TAM產(chǎn)生的免疫抑制因子也減少。因此IDH 1/2-mu LGG患者預(yù)后較IDH 1/2-wt LGG好，可能與兩者間TAM的浸潤數(shù)量及免疫抑制狀態(tài)存在差異相關(guān)。IDH 1/2突變的膠質(zhì)瘤細(xì)胞釋放TAM趨化因子較少，導(dǎo)致TAM浸潤數(shù)量減少，總體產(chǎn)生的免疫抑制因子減少，免疫抑制作用減弱，促進(jìn)腫瘤增殖、遷移和侵襲的功能減低，患者總生存期更長。

已有的研究表明，IDH 1/2突變狀態(tài)對LGG患者預(yù)后的預(yù)測優(yōu)于組織學(xué)分級[30]，但臨床實踐表明IDH突變狀態(tài)相同的患者對治療的反應(yīng)和預(yù)后不盡相同，目前尚無可靠指標(biāo)能夠進(jìn)一步預(yù)測IDH 1/2-mu LGG亞型或IDH 1/2-wt LGG亞型的預(yù)后。腫瘤石蠟切片免疫組化染色和TCGA數(shù)據(jù)分析的結(jié)果表明，IDH 1/2-wt LGG和IDH 1/2-mu LGG中TAM的浸潤數(shù)量及免疫抑制程度存在差異，進(jìn)一步探討了相關(guān)指標(biāo)對IDH 1/2-wt LGG患者和IDH 1/2-mu LGG患者預(yù)后預(yù)測的價值，發(fā)現(xiàn)CD163highIDH 1/2-wt LGG組和CD163lowIDH 1/2-wt LGG組的2年和5年總生存率以及IL- 10highIDH 1/2-mu LGG組和IL-10lowIDH 1/2-mu LGG組的5年總生存率間存在明顯差異。因此，上述結(jié)果表明，通過檢測CD163和IL-10的表達(dá)水平，可以在IDH1/2突變狀態(tài)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步分別預(yù)測IDH 1/2-wt LGG患者和IDH 1/2-mu LGG患者的預(yù)后。

綜上所述，IDH 1/2-wt LGG和IDH 1/2-mu LGG中TAM的浸潤數(shù)量及免疫抑制狀態(tài)存在差異，CD163和IL-10表達(dá)水平分別具有預(yù)測IDH 1/2-wt LGG和IDH 1/2-mu LGG患者預(yù)后的價值。后期的研究將嘗試把TAM浸潤指標(biāo)的表達(dá)水平與患者對放化療的獲益程度結(jié)合分析，篩選對患者治療方案有指導(dǎo)意義的指標(biāo)，建立LGG患者放化療敏感性預(yù)測模型。