骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腎移植受者T淋巴細(xì)胞分化和miRNA-155表達(dá)的影響

朱凌峰 陳書(shū)尚 蔡錦全 譚建明 翁明芳

腎移植是終末期腎病最有效的治療方法，但排斥反應(yīng)仍是影響腎移植受者生存的重要因素之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種多能干細(xì)胞，具有多種生物學(xué)功能[1-2]。前期研究中發(fā)現(xiàn)自體MSCs免疫誘導(dǎo)可降低腎移植患者術(shù)后急性排斥反應(yīng)和機(jī)會(huì)感染的風(fēng)險(xiǎn)、促進(jìn)腎功能恢復(fù)[3]，證實(shí)了MSCs具有免疫調(diào)節(jié)能力，但其作用機(jī)制仍未完全闡明。本研究觀察了MSCs腎移植受者T淋巴細(xì)胞分化和miRNA-155表達(dá)的影響，探討MSCs的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

資料與方法

一、資料

MSCs組腎移植受者20例，供腎均來(lái)源于器官捐獻(xiàn)，于2013年1月至2017年12月接受MSCs誘導(dǎo)+同種異體腎移植術(shù)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。平均年齡（40.1±9.4）歲，均為首次移植。對(duì)照組：于同期行異體腎移植的受者中，以1 : 1配對(duì)的方法，選擇年齡、性別、原發(fā)病、尿毒癥病程、供腎缺血時(shí)間、移植次數(shù)、配型和淋巴毒試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)組匹配的腎移植受者20例。兩組患者術(shù)后免疫抑制方案均為霉酚酸酯+他克莫司+強(qiáng)的松。

二、方法

1. MSCs免疫誘導(dǎo)方案：分別于腎移植術(shù)中、術(shù)后 2周，將1 ～ 2×106個(gè)/kg自體 MSCs經(jīng)外周靜脈輸注 MSCs懸液（細(xì)胞數(shù)為 1 ～ 2×106/kg·次）。MSCs的制備、保存和輸注采用本中心之前報(bào)道的方法[3]。

2.外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞/ CD4+細(xì)胞亞群比值和測(cè)定：兩組患者分別于移植術(shù)前、術(shù)后第15天抽取靜脈血2 ml，加入抗CD25- APC、抗CD4-FITC及抗FoxP3-PE，充分混后加入紅細(xì)胞裂解液，避光孵育l5 ～ 25 min；PBS洗滌后，按照流式細(xì)胞儀檢測(cè)程序，檢測(cè)兩組患者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞/CD4+細(xì)胞亞群比值。

3.外周血細(xì)胞因子濃度檢測(cè)：兩組患者分別于移植術(shù)前、術(shù)后第15天抽取靜脈血，分離血清，采用ELISA法檢測(cè)白細(xì)胞介素2（IL-2）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）和白細(xì)胞介素 10（IL-10）濃度。操作嚴(yán)格按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

4.免疫磁珠分選外周血T淋巴細(xì)胞：于移植術(shù)前、術(shù)后第15天抽取患者外周血，采用密度梯度離心法，將全血加到Percoll淋巴細(xì)胞分離液上方（比重為1.077 g/L），以1 000×g離心10 min，按說(shuō)明書(shū)指示吸取分離介質(zhì)之間的外周血單個(gè)核細(xì)胞，洗滌、離心后棄上清液。細(xì)胞沖洗混懸、計(jì)數(shù)，加入CD3 MagCellect免疫磁珠，4 ℃下孵育30 min。置于磁體中6 min，通過(guò)磁性分離柱獲得外周血T淋巴細(xì)胞。

5. Rea1-time PCR法檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞中miRNA-155的表達(dá)：免疫磁珠分選的T淋巴細(xì)胞，加入裂解液裂解，Trizol法提取細(xì)胞總RNA模板。內(nèi)參為小分子RNA U6，Rea1-time PCR采用兩步法反應(yīng)程序。以O(shè)pticon Monitor Software 3.1版軟件分析數(shù)據(jù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，各組目的基因表達(dá)情況用ΔΔCt 值統(tǒng)計(jì)比較。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行處理數(shù)據(jù)。外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞/CD4+細(xì)胞比值、IL-2、TNF-α和IL-10水平、T淋巴細(xì)胞miRNA-155表達(dá)量以± s表示，對(duì)照組與處理組間均數(shù)比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，治療前后均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜ 0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組腎移植受者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞/CD4+細(xì)胞比值比較（%，± s）

表1 兩組腎移植受者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞/CD4+細(xì)胞比值比較（%，± s）

分組 例數(shù) 移植前 術(shù)后15 d t 值 P值對(duì)照組 10 10.88±2.11 26.06±4.77 9.629 P ＜ 0.001 MSCs組 10 11.60±2.82 30.44±4.23 10.154 P ＜ 0.001 t 值 0.534 2.365 P值 0.606 0.042

表2 MSCs對(duì)腎移植受者外周血炎性因子表達(dá)水平的影響（ng/L ，± s）

表2 MSCs對(duì)腎移植受者外周血炎性因子表達(dá)水平的影響（ng/L ，± s）

注：與術(shù)前比較，aP ＜0.01

分組 例數(shù)IL-2 TNF-α IL-10術(shù)前 術(shù)后15 d 術(shù)前 術(shù)后15 d 術(shù)前 術(shù)后15 d對(duì)照組 10 25.08±3.57 31.40±5.33a 56.57±5.46 46.67±6.71a 11.71±3.91 16.63±6.26a MSCs組 10 25.14±4.10 27.47±4.30 56.46±4.94 41.52±8.32a 11.83±4.08 20.35±5.10 t 值 0.049 2.252 0.064 2.157 0.095 2.062 P值 0.961 0.015 0.949 0.037 0.925 0.046

表3 MSCs對(duì)腎移植受者外周血T淋巴細(xì)胞miRNA-155表達(dá)的影響（± s）

表3 MSCs對(duì)腎移植受者外周血T淋巴細(xì)胞miRNA-155表達(dá)的影響（± s）

分組 例數(shù) 術(shù)前 術(shù)后15 d t 值 P值對(duì)照組 10 0.90±0.13 1.89±0.15 22.806 P ＜ 0.001 MSCs組 10 0.90±0.11 1.61±0.31 9.725 P ＜ 0.001 t 值 0.120 3.688 P值 0.905 0.001

結(jié) 果

一、MSCs對(duì)外周血CD4+ CD25+ FoxP3+ Treg細(xì)胞/CD4+細(xì)胞亞群比值的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，移植前兩組腎移植受者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞/CD4+細(xì)胞比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而術(shù)后第15天，MSCs組外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞/CD4+細(xì)胞亞群比值高于對(duì)照組（P＜ 0.01，表 1）。

二、MSCs對(duì)外周血IL-2、TNF-α和IL-10濃度的影響

EILISA檢測(cè)結(jié)果顯示，移植前兩組受者外周血IL-2、TNF-α和IL-10水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。移植后15天，與術(shù)前相比，對(duì)照組外周血IL-2（t=4.401，P＜ 0.001）和 IL-10（t= 5.118，P＜ 0.001）水平均上升，而 TNF-α 則下降（t= 2.979，P= 0.005）；與對(duì)照組相比，MSCs組外周血IL-2和TNF-α水平均下降，而IL-10則上升（表2）。

三、MSCs對(duì)腎移植術(shù)后外周血T淋巴細(xì)胞miRNA-155表達(dá)的影響

Rea1-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，移植前兩組腎移植受者外周血T淋巴細(xì)胞的miRNA-155表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。移植后15天，兩組患者外周血T淋巴細(xì)胞的miRNA-155表達(dá)水平均高于移植前；與對(duì)照組相比，MSCs組的miRNA-155表達(dá)水平降低（表3）。

討 論

誘導(dǎo)移植免疫耐受是目前器官移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。骨髓MSCs是目前研究范圍最為廣泛的成體干細(xì)胞之一，不僅具有多向分化潛能，還具有免疫調(diào)節(jié)等多種功能[1-5]。前瞻性臨床研究發(fā)現(xiàn)，異體腎移植聯(lián)合自體MSCs輸注，能促進(jìn)腎功能恢復(fù)，且術(shù)后急性排斥反應(yīng)和機(jī)會(huì)感染的風(fēng)險(xiǎn)降低，證實(shí)了MSCs能誘導(dǎo)腎移植術(shù)后免疫耐受[3]，但具體的體內(nèi)作用機(jī)制尚不明確。

T淋巴細(xì)胞在腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，參與了移植物抗原識(shí)別、分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫、溶細(xì)胞效應(yīng)等免疫應(yīng)答[6]。監(jiān)測(cè)腎移植受者外周血T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能狀態(tài)，有助于了解移植患者的免疫狀態(tài)[7-8]。本研究之前采用ImmuKnow法檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞ATP含量，動(dòng)態(tài)觀察MSCs和舒萊誘導(dǎo)的腎移植受者術(shù)后外周血CD4+T細(xì)胞的免疫功能，發(fā)現(xiàn)MSCs誘導(dǎo)能有效抑制患者細(xì)胞免疫功能[9]。體外研究發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠抑制CD4+T淋巴細(xì)胞增殖，抑制T淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等Th1類細(xì)胞因子，促進(jìn)IL-10等Th2類細(xì)胞因子的產(chǎn)生[5,10]。吳衛(wèi)真等[11]在親屬供腎腎移植移植術(shù)前，經(jīng)門靜脈注射供者的骨髓細(xì)胞，與一般腎移植受者相比，移植腎排斥發(fā)生率和免疫抑制劑用量降低，且患者外周血IL-10升高，TNF-a表達(dá)升高，表現(xiàn)出免疫低反應(yīng)性。本研究也有類似發(fā)現(xiàn)，MSCs組移植術(shù)后15天的外周血IL-2和TNF-α水平較對(duì)照組均下降，而IL-10則上升。此外，體外研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可誘導(dǎo)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中Treg細(xì)胞的分化并促進(jìn)其增殖[12]。本研究中，移植術(shù)后第15 天，MSCs組外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞/CD4+細(xì)胞亞群比值高于對(duì)照組，說(shuō)明MSCs在體內(nèi)也對(duì)Treg細(xì)胞有促進(jìn)作用。

miRNA-155位于人類21號(hào)染色體，在T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等多種活化的免疫細(xì)胞中均高表達(dá)，在免疫細(xì)胞的激活中起著重要作用，而其表達(dá)受到多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)[13]。此外，miRNA-155對(duì)CD4+T細(xì)胞的亞群分化和免疫功能具有重要的調(diào)節(jié)功能，可通過(guò)IFN-γ-STAT1通路促進(jìn)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化和樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-2[14]。miRNA-155對(duì)Treg的細(xì)胞數(shù)量和功能狀態(tài)均具有調(diào)節(jié)作用：可促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞、維持Treg數(shù)量的作用、降低效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)Treg抑制作用的敏感性[15-16]。

MSCs和miRNA-155均可通過(guò)作用于T淋巴細(xì)胞的亞群分化而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，但MSCs是否通過(guò)miRNA-155發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用仍不明確。我們先前的體外研究發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠降低被激活的T淋巴細(xì)胞miRNA-155的表達(dá)水平[17]。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，MSCs在體內(nèi)也具有下調(diào)T淋巴細(xì)胞miRNA-155表達(dá)的作用。這些結(jié)果提示：MSCs作用于T淋巴細(xì)胞后，影響相應(yīng)細(xì)胞因子和miRNA-155的表達(dá)，進(jìn)而影響T淋巴細(xì)胞亞群分化和免疫功能，誘導(dǎo)腎移植后免疫耐受。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，MSCs可升高腎移植受者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞/CD4+細(xì)胞亞群比值、影響相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平、降低T淋巴細(xì)胞miRNA-155表達(dá)，這些作用與MSCs誘導(dǎo)腎移植術(shù)后免疫耐受有關(guān)。