2011－2016年上海市兒童醫(yī)院臨床分離細(xì)菌耐藥性監(jiān)測

王 春， 姚劍杰， 孫 燕， 秦惠宏， 潘 芬， 石迎迎， 張 泓， 葛青瑋

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)菌 收集2011年1月—2016年12月上海市兒童醫(yī)院臨床分離的菌株，剔除同一患者分離的重復(fù)菌株及非無菌部位分離到的凝固酶陰性葡萄球菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）[3]推薦采用需氧菌藥敏培養(yǎng)基：MH瓊脂培養(yǎng)基（上海伊華生物技術(shù)公司）；苛氧菌藥敏瓊脂培養(yǎng)基：5%脫纖維羊血MH瓊脂、HTM瓊脂（上?？片敿紊锛夹g(shù)公司）。

1.1.3 抗菌藥物紙片和E試驗(yàn)條 抗菌藥物紙片均為英國OXOID公司產(chǎn)品；青霉素、萬古霉素和替考拉寧E試驗(yàn)條為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果參照CLSI 2016年標(biāo)準(zhǔn)[3]判斷，磷霉素的判斷標(biāo)準(zhǔn)僅針對尿標(biāo)本分離的糞腸球菌；替加環(huán)素的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）文件標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、大腸埃希菌產(chǎn)酶株ATCC 35218、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、銅綠假單胞菌ATCC 27853、糞腸球菌ATCC 29212、肺炎鏈球菌ATCC 49619、流感嗜血桿菌ATCC 49247。

1.2.2 β內(nèi)酰胺酶檢測[3]采用頭孢硝噻吩試驗(yàn)定性檢測流感嗜血桿菌的β內(nèi)酰胺酶。按CLSI推薦的紙片法篩選和酶抑制增強(qiáng)確證試驗(yàn)檢測大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌中的產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）菌株。

1.2.3 青霉素不敏感肺炎鏈球菌（PNSP）的檢測 經(jīng)苯唑西林紙片法測定抑菌圈直徑≤19 mm的肺炎鏈球菌采用青霉素E試驗(yàn)條測定其最低抑菌濃度（MIC），腦膜炎分離株和非腦膜炎分離株分別按CLSI 2016年標(biāo)準(zhǔn)[3]判定為青霉素敏感、中介或耐藥株（PSSP、PISP或PRSP）。

1.2.4 耐萬古霉素腸球菌（VRE）檢測 經(jīng)萬古霉素紙片法測定結(jié)果為非敏感株者用萬古霉素和替考拉寧E試驗(yàn)條[3]復(fù)測確認(rèn)。

2) 冷卻著火儲罐罐壁。針對著火儲罐罐壁進(jìn)行冷卻，減少罐內(nèi)油品熱傳導(dǎo)，一定程度上能避免沸溢。研究表明，有罐壁冷卻比無罐壁冷卻的油品燃燒線速度減小25%～30%，采用冷卻措施后儲罐發(fā)生沸溢時(shí)間有所延長，但儲罐如已形成熱層，罐壁冷卻措施的作用將有限。

1.2.5 特殊耐藥菌株定義 廣泛耐藥菌（XDR）指對除多黏菌素和替加環(huán)素外的其他抗菌藥物全部耐藥的菌株[4]。碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（CRE）定義[4]為對亞胺培南、美羅培南或厄他培南中任一種藥物耐藥者。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用WHONET 5.6軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌及其分布

2011－2016年共分離到臨床菌株23 259株，其中革蘭陽性菌10 885株（46.8%），革蘭陰性菌12 374株（53.2%）。6年中每年革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的占比及主要細(xì)菌占比見表1 ，基本無明顯差異。革蘭陽性菌主要以鏈球菌屬和金黃色葡萄球菌多見；革蘭陰性菌主要以大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和流感嗜血桿菌多見。

23 259株細(xì)菌中，住院和門診患者各占84.0%和16.0%。標(biāo)本分布情況顯示：痰液等呼吸道標(biāo)本占52.3%、血液13.6%、尿液12.7%、傷口膿液6.3%、糞便4.8%、無菌體液2.0%、陰道拭子1.0%和其他標(biāo)本7.3%。呼吸道標(biāo)本仍以肺炎鏈球菌（22.7%）為主，血液標(biāo)本以凝固酶陰性葡萄球菌（71.6%）為主，尿液標(biāo)本以大腸埃希菌（52.3%）為主。

2.2 革蘭陽性球菌對抗菌藥物的耐藥性

2.2.1 鏈球菌屬 2 916株肺炎鏈球菌中，腦膜炎株9株，非腦膜炎株2 907株。9株腦膜炎分離株中，1株對青霉素敏感，其余均為青霉素耐藥株。2 907株非腦膜炎肺炎鏈球菌中PNSP的檢出率為31.2%，PSSP的檢出率為68.8%。藥敏結(jié)果顯示肺炎鏈球菌對紅霉素、克林霉素耐藥率最高（＞90%），對甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率較高（＞65%），未發(fā)現(xiàn)喹諾酮類、萬古霉素、利奈唑胺耐藥株，見表2。

表1 2011－2016年主要臨床分離菌的分布Table 1 Distribution of bacterial species isolated from children between 2011 and 2016[n ( % ) ]

表2 2011－2016年非腦膜炎肺炎鏈球菌對抗菌藥物的耐藥率Table 2 Resistance of non-meningitis S. pneumoniae to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

β溶血鏈球菌中主要以化膿鏈球菌為主，對紅霉素和克林霉素耐藥率高（＞90%），未發(fā)現(xiàn)對青霉素、頭孢曲松、萬古霉素和利奈唑胺耐藥菌株，見表3。無乳鏈球菌對青霉素、頭孢曲松保持較高敏感率（＞90%），對紅霉素、克林霉素耐藥率為50%左右，未發(fā)現(xiàn)萬古霉素、利奈唑胺耐藥菌株。

2.2.2 葡萄球菌屬 葡萄球菌屬中，MRSA和MRCNS分別占各自菌種的35.8%和82.2%。MRSA和MRCNS對β內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類和喹諾酮類的耐藥率均顯著高于MSSA和MSCNS。未發(fā)現(xiàn)對利奈唑胺、萬古霉素和替考拉寧耐藥的葡萄球菌。見表4、表5。

表3 2011－2016年化膿鏈球菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility of Streptococcus pyogenes to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表4 2011－2016年金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 4 Susceptibility of S. aureus to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表4 （續(xù)）Table 4（continued）（%）

表5 2011－2016年凝固酶陰性葡萄球菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 5 Susceptibility of coagulase negative Staphylococcus to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

2.2.3 腸球菌屬 953株腸球菌屬中，糞腸球菌428株（44.9%），屎腸球菌365株（38.3%），其他腸球菌160株（16.8%）。屎腸球菌對所測試的抗菌藥物耐藥率高于糞腸球菌。目前未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素、利奈唑胺和替考拉寧耐藥菌株。見表6。

2.3 革蘭陰性桿菌對抗菌藥物的耐藥性

2.3.1 腸桿菌科 大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBL平均檢出率分別是61.1%和75.1%。產(chǎn)ESBL菌株對所測試藥物的耐藥率均比非產(chǎn)ESBL株高。大腸埃希菌對碳青霉烯類最敏感，耐藥率＜3%，其次為阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦和頭孢哌酮-舒巴坦，6年總體耐藥率分別為4.4%、4.8%、6.6%。各年大腸埃希菌對所測試抗菌藥物耐藥率和敏感率見表7。

表6 2011－2016年糞腸球菌和屎腸球菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 6 Susceptibility of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016

表7 2011－2016年大腸埃希菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 7 Susceptibility of Escherichia coli strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表7 （續(xù)）Table 7（continued）（%）

6年間肺炎克雷伯菌對所測試抗菌藥物耐藥率整體呈上升趨勢，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別由2011年的3.1%和4.8%上升至28.7%和37.4%，對阿米卡星、環(huán)丙沙星的耐藥率分別從3.1%和5.8%上升至36.1%和47.5%，對哌拉西林-他唑巴坦和頭孢哌酮-舒巴坦分別從20.6%和14.2%上升至50.4%和49.9%，對頭孢菌素的耐藥率也呈上升趨勢，2016年耐藥率＞65%，見表8。

表8 2011－2016年肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 8 Susceptibility of Klebsiella pneumoniae to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

6年共分離到272株鼠傷寒沙門菌和235株腸炎沙門菌，兩者對氨芐西林耐藥率較高（＞70%）。腸炎沙門菌對甲氧芐啶-磺胺甲唑、氯霉素的敏感率＞90%，鼠傷寒沙門菌對頭孢曲松的敏感率最高（75.8%），其次是甲氧芐啶-磺胺甲唑（64.2%）。見表9。

2.3.2 不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌 2011－2016年共分離739株銅綠假單胞菌和1 366株鮑曼不動(dòng)桿菌。各年對抗菌藥物耐藥率見表10、表11。銅綠假單胞菌對所測試抗菌藥物耐藥率變化不大，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率均為15%左右。鮑曼不動(dòng)桿菌對大多數(shù)抗菌藥物的耐藥率呈上升趨勢，除了對頭孢哌酮-舒巴坦的耐藥率為26.7%，對其他所測試抗菌藥物的耐藥率大多＞50%，對碳青霉烯類（亞胺培南和美羅培南）耐藥率較高，6年總體耐藥率分別是62.7%和63.5%。

2.3.3 XDR革蘭陰性桿菌 革蘭陰性桿菌中，XDR細(xì)菌主要有鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌，其中鮑曼不動(dòng)桿菌6年XDR占比呈逐年下降趨勢（27.3%下降到20.0%）；而肺炎克雷伯菌呈上升趨勢（0上升到14.9%），見表12。

2.3.4 流感嗜血桿菌 6年共分離流感嗜血桿菌1 747株，β內(nèi)酰胺酶檢出率40.7%。流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥率48.6%，對甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率最高為71.2%，對頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、阿奇霉素的不敏感率分別為14.4%、4.5%、17.6%，見表13。

表9 2011－2016年沙門菌屬對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 9 Susceptibility of Salmonella spp. strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表10 2011－2016年銅綠假單胞菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 10 Susceptibility of P. aeruginosa strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表11 2011－2016年鮑曼不動(dòng)桿菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 11 Susceptibility of A. baumannii strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

3 討論

統(tǒng)計(jì)2011－2016年我院細(xì)菌數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)顯示：革蘭陽性菌和陰性菌所占比率均保持在50%左右，與同期2011－2015年CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)存在一定的差異[5-8]。6年間以鏈球菌屬總體檢出率最高（17.1%，3 982/23 259），主要以肺炎鏈球菌和化膿鏈球菌多見，這與綜合性醫(yī)院檢出情況存在一定差異，且上述細(xì)菌主要分離自呼吸道標(biāo)本，這可能與兒童人群上呼吸道感染主要以化膿鏈球菌多見，下呼吸道感染主要以肺炎鏈球菌多見這一現(xiàn)象存在一定的相關(guān)性。

表11 （續(xù)）Table 11（continued）（%）

表12 2011－2016年XDR革蘭陰性菌分離情況Table 12 Prevalence of XDR gram-negative strains by year from 2011-2016

表13 2011－2016年流感嗜血桿菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 13 Susceptibility of H. in fl uenzae strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

6年中我院監(jiān)測到的臨床菌株主要來源于痰液等呼吸道標(biāo)本（52.3%），其次為血液（13.6%）和尿液（12.7%）標(biāo)本，與2011－2016年CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)一致[5-9]。呼吸道標(biāo)本仍是臨床上最常見的樣本，與我院呼吸科床位數(shù)比例較高（占全院病床數(shù)的10%）有一定關(guān)系。不同標(biāo)本中分離到細(xì)菌的種類差異較大，痰液等呼吸道標(biāo)本中以肺炎鏈球菌（22.7%）、金黃色葡萄球菌（19.2%）和流感嗜血桿菌（13.8%）為主；咽拭子以化膿鏈球菌（54.0%）和金黃色葡萄球菌（9.1%）為主，這一結(jié)果顯示兒童呼吸系統(tǒng)感染主要以苛養(yǎng)菌為主，與成人明顯不同[9]。血液標(biāo)本以凝固酶陰性葡萄球菌（71.6%）、肺炎克雷伯菌（3.9%）和大腸埃希菌（3.8%）為主；尿液標(biāo)本以大腸埃希菌（52.3%）、糞腸球菌（7.6%）和屎腸球菌（7.3%）為主；糞便標(biāo)本中沙門菌的分離率在增加，志賀菌有所減少，可能與民眾生活條件改善有關(guān)。

本次監(jiān)測中金黃色葡萄球菌在革蘭陽性菌中檢出率最高，也是引起醫(yī)院和社區(qū)呼吸道感染的主要病原菌。6年間MRSA主要分離自呼吸道標(biāo)本，其次為傷口膿液，分離率由2011年27.4%上升至2016年42.9%，而2011－2016年CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示成人MRSA檢出率不斷下降（從2011年60.1%持續(xù)下降到2016年的38.4%），這一現(xiàn)象需引起重視。6年來門診患兒檢出金黃色葡萄球菌228株，其中MRSA檢出率為20.2%（46/228）；住院患者檢出金黃色葡萄球菌2 903株，其中MRSA檢出率37.0%（1 074/2 903），住院患者M(jìn)RSA分離率高于門診患者[9]。MRCNS略有下降，由2011年87.0%下降至2016年79.6%，主要分離自血液及無菌體液標(biāo)本。MRSA和MRCNS對所測試抗菌藥物的耐藥率顯著高于MSSA和MSCNS。MRSA對利福平和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥率較低（＜15%），MRCNS對利福平的耐藥率＜10%，對甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率顯著高于MRSA，兩者均未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素、利奈唑胺、替考拉寧耐藥株。

肺炎鏈球菌是檢出率僅次于金黃色葡萄球菌的革蘭陽性菌，可引起兒童細(xì)菌性肺炎、腦膜炎和急性中耳炎等相關(guān)感染性疾病。本次監(jiān)測肺炎鏈球菌在呼吸道標(biāo)本中檢出率最高，非腦膜炎PNSP平均檢出率為31.2%，對紅霉素和克林霉素耐藥率最高（＞90%），其次為甲氧芐啶-磺胺甲唑（＞65%），都較成人報(bào)道高，未檢出萬古霉素和利奈唑胺耐藥株。腸球菌屬中，屎腸球菌對絕大多數(shù)測試抗菌藥物的耐藥率顯著高于糞腸球菌，未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素和利奈唑胺的耐藥菌株。

大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌是本次檢出率排名前2位的革蘭陰性菌。6年間肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBL的平均檢出率高于大腸埃希菌產(chǎn)ESBL率。碳青霉烯類抗生素被認(rèn)為是臨床治療革蘭陰性桿菌感染的最后一道防線。隨著一系列碳青霉烯酶的出現(xiàn)，臨床分離的碳青霉烯類耐藥菌日益增多，并且這些病原菌常同時(shí)攜帶其他多種耐藥基因，幾乎對所有抗菌藥物耐藥，該類菌引起的感染有很高的病死率。我院細(xì)菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示：大腸埃希菌對碳青霉烯類仍保持較高的敏感率（耐藥率＜3%），但肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類的耐藥率呈逐年上升趨勢。本監(jiān)測顯示，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）對亞胺培南耐藥率從2011年的3.1%上升至2016年的28.7%，與2005－2014年CHINET報(bào)道結(jié)果一致[10]，其升高原因考慮可能與患者的一般情況差、以往使用過抗菌藥物、入住ICU、實(shí)質(zhì)臟器或血液移植、外科手術(shù)、導(dǎo)管和引流管留置等因素有關(guān)[11]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)碳青霉烯酶，其中成人CRKP主要以產(chǎn)KPC-2酶為主，兒童CRKP主要以金屬酶NDM-1為主[12-13]。同時(shí)深入研究發(fā)現(xiàn)我院CRKP以金屬酶NDM-1多見，主要在新生兒人群中播散流行[13]，針對此現(xiàn)象，需加強(qiáng)對重點(diǎn)病區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查，采取積極有效的感控措施防止耐藥菌在病區(qū)流行引起大范圍擴(kuò)散。

鮑曼不動(dòng)桿菌是我院革蘭陰性桿菌中耐藥率最高的菌種，也是目前醫(yī)院感染面臨的最重要的問題。該菌對亞胺培南的耐藥率從2011年的38.3%上升至2016年的68.4%，對其他受試抗菌藥物的耐藥率6年間呈鋸齒形波動(dòng)，提示可能存在該類菌株的克隆傳播。需采取有效措施防止其進(jìn)一步擴(kuò)散。但兒童患者銅綠假單胞菌的耐藥率變化不大，如對亞胺培南和美羅培南的耐藥率6年間分別為4.7%～18.8%和4.7%～19.4%。

流感嗜血桿菌為兒童社區(qū)獲得性肺炎的另一種重要病原菌。此次監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示β內(nèi)酰胺酶檢出率在30%～60%，氨芐西林耐藥率33.7%～54.6%，且已出現(xiàn)β內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥菌株（BLNAR）。文獻(xiàn)報(bào)道流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥的主要機(jī)制是產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶水解β內(nèi)酰胺類抗生素，常見的β內(nèi)酰胺酶有TEM-Ⅰ和ROB-Ⅰ型2種，其中90%以上為TEM-Ⅰ型[14]，BLNAR的耐藥機(jī)制是ftsI基因氨基酸位點(diǎn)突變引起青霉素結(jié)合蛋白PBP的結(jié)構(gòu)改變使與氨芐西林等其他β內(nèi)酰胺類抗生素的親和力降低，不能被β內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制[15]。通過進(jìn)一步對我院流感嗜血桿菌耐藥性和基因型分型的研究，表明我院呼吸道分離流感嗜血桿菌ftsI基因突變率高，以Ⅲ型為主，ftsI基因突變增加了流感嗜血桿菌對氨芐西林和頭孢呋辛的耐藥率[15]。

綜上所述，6年監(jiān)測數(shù)據(jù)表明患兒不同標(biāo)本中細(xì)菌的分布各有特點(diǎn)，多重耐藥菌株MRSA、CRKP、CRAB不斷增長，特別是CRKP的顯著增長不容忽視，需重視兒童耐藥菌的監(jiān)測，采取積極有效的防控措施，及時(shí)阻斷耐藥菌株的播散和流行，增強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員的衛(wèi)生意識。