嬰幼兒配方奶粉中維生素B1的檢測及其衍生物穩(wěn)定性的研究

倪煒華，陳妍，邊國軍

（嘉興市食品藥品檢驗檢測院，浙江嘉興314000）

0 引言

維生素B1又稱硫胺素或抗神經(jīng)炎維生素或抗腳氣病維生素，為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，由嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)通過亞甲基結(jié)合而成的一種B族維生素[1]。維生素B1主要存在于種子的外皮和胚芽中，如米糠和麩皮中含量很豐富，在酵母菌中含量也極豐富[2]。瘦肉、白菜和芹菜中含量也較豐富。所用的維生素B1都是化學(xué)合成的產(chǎn)品。在體內(nèi)，維生素B1以輔酶形式參與糖的分解代謝，有保護神經(jīng)系統(tǒng)的作用；還能促進腸胃蠕動，增加食欲[3]。維生素B1缺乏時，可引起多種神經(jīng)炎癥，如腳氣病[4]。維生素B1缺乏所引起的多發(fā)性神經(jīng)炎，患者的周圍神經(jīng)末梢有發(fā)炎和退化現(xiàn)象，并伴有四肢麻木、肌肉萎縮、心力衰竭、下肢水腫等癥狀[5-6]。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上，維生素B1制劑治療腳氣病和多種神經(jīng)炎癥有顯著療效。

目前測定奶粉中維生素B1的方法主要有：熒光分光光度法[7-8]、液相色譜法[9-10]、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[11]。新版國標(biāo)方法GB 5009.84-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素B1的測定》第一法中指出衍生物在室溫條件下4 h內(nèi)穩(wěn)定[12]，這給我們?nèi)粘５呐繖z測帶來了一定的難度。本文通過建立測定嬰幼兒配方奶粉中維生素B1的高效液相色譜法，并對其衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性進行研究，找到一個適合批量檢測的方法。

1 試驗

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀，Agilent 1200型，美國Agilent公司；電子分析天平，BS210S型，德國賽多利斯公司；p H計，F(xiàn)E20型，梅特勒-托利多儀器有限公司；立式滅菌鍋，LMQ.C/3885型，山東新華醫(yī)療器械有限公司；生化培養(yǎng)箱，SPX-400-型，上海躍進醫(yī)療器械有限公司。

維生素B1，純度為95.7%，德國D rEhrenstorfer公司；木瓜蛋白酶，酶活力大于600 U/m g，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；淀粉酶，酶活力大于4 000 U/g，上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；甲醇，HPLC級，德國M erck公司；正丁醇，HPLC級，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；冰乙酸，HPLC級，美國TED IA公司；氫氧化鈉，優(yōu)級純，永華化學(xué)科技有限公司；鐵氰化鉀，分析純，上海強順化學(xué)試劑有限公司；鹽酸，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為超純水；樣品奶粉，市售。

1.2 實驗條件

色譜柱：色譜柱為Agilent公司的SB C 18(150 mm×4.6 mm×5μm)；柱溫：30℃；進樣體積：20μL；流動相：甲醇：0.05 mol/L乙酸鈉溶液=35∶65；流速：1.0 mL/min；檢測波長：激發(fā)波長375 nm,發(fā)射波長435 nm。

1.3 樣品處理

提取準(zhǔn)確稱取5 g勻質(zhì)樣品（準(zhǔn)確到0.0001g）于250 mL錐形瓶中，加60 m L0.1 mol/L鹽酸溶液，充分搖勻，塞上軟質(zhì)塞子，高壓滅菌鍋中121℃保持30 min。水解結(jié)束待冷卻至40℃以下取出，輕搖數(shù)次，用pH計指示，用2.0 mol/L乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.0左右,加入2.0 mL混合酶（1.76 g木瓜蛋白酶、1.27 g淀粉酶,加水定容至50 mL）溶液，搖勻后，置于培養(yǎng)箱中37℃過夜(約16 h)。將酶解液全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，用濾紙過濾,取上清液備用。

準(zhǔn)確移取上述濾液2.0 mL于10 mL試管中，加入1.0 mL堿性鐵氰化鉀溶液（將5 mL 20 g/L鐵氰化鉀溶液與200 mL 100 g/L氫氧化鈉溶液混合）,渦旋混勻后，準(zhǔn)確加入2.0 mL正丁醇，再次渦旋混勻后靜置約10 min，待充分分層后,吸取正丁醇相(上層)經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾，取濾液于進樣瓶中。另取2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)系列工作液,與試液同步進行衍生化，過0.22μm有機濾膜，供HPLC測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性的研究

用本方法分別對雅培嬰兒配方奶粉，較大嬰兒配方奶粉，幼兒配方奶粉中的維生素B1進行含量的測定。同時對維生素B1衍生產(chǎn)物在一定條件下，一定時間段內(nèi)的峰面積進行比較，主要有棕色進樣瓶與透明進樣瓶，冷藏與室溫，以及在7 d之內(nèi)選取9個時間點，在相同儀器條件下，對峰面積進行測定，并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。具體情況見表1。

通過表1可以看到，維生素B1在衍生后，保存條件對其影響不大，在16 h內(nèi)有明顯的降解(在10%以內(nèi))，16 h后直至7 d內(nèi)，維生素B1衍生產(chǎn)物含量趨于穩(wěn)定。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，儲存條件及時間對峰面積均無顯著差異（P＞0.05）。標(biāo)樣與樣品有相同的降解規(guī)律，考慮到標(biāo)樣與樣品是同時衍生的，進樣不可避免有時間差，為了減少誤差，維生素B1衍生后，適合在第二天進行檢測。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

配制維生素B1質(zhì)量濃度為100 m g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋配成質(zhì)量濃度為（0.05，0.1，0.2，0.5，1.0）m g/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，各取2.0 m L，按實驗方法進行衍生處理，以所得峰面積對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度進行回歸分析，線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)見表2。按實驗方法檢測空白奶粉(5 g)中添加1.0μg維生素B1的樣品，維生素B1的信噪比均大于3，因此把本方法的檢出限定為0.2 mg/kg。我國目前檢測維生素B1的方法中檢出限為0.3 mg/kg，本實驗方法滿足嬰幼兒配方奶粉中維生素B1的檢測要求。線性回歸方程式、線性相關(guān)系數(shù)和檢出限（S/N=3）見表2。

表1 維生素B1衍生產(chǎn)物在不同儲存條件、不同時間下的峰面積 (mAU·s)

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

2.3 回收率和精密度試驗

以空白奶粉樣品為基體，添加維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法及儀器條件進行回收率試驗，每個添加水平作6次平行，添加水平、平均回收率及精密度見表3。

表3 回收率及精密度試驗結(jié)果

由表3可知，空白奶粉中維生素B1含量檢測，添加水平在0.5、1.0、5.0 m g/kg時，平均回收率為89.6%～97.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.28%～3.64%，符合相關(guān)規(guī)定要求。

2.4 樣品的測定

按方法1.3進行取樣測定，并用GB 5009.84-2016規(guī)定的方法進行對照，由表4可知，本方法測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度較為滿意。

表4 奶粉中維生素B1含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了嬰幼兒配方奶粉中維生素B1含量檢測的方法，該方法能滿足日常對嬰幼兒配方奶粉中維生素B1含量檢測的要求。同時對維生素B1衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性進行了研究，GB 5009.84-2016對維生素B1衍生后要求在4 h內(nèi)進樣，但通過對3個不同階段奶粉，在不同的儲存條件下，在不同時間點進行檢測的方法，結(jié)果表明維生素B1衍生后保存條件對其含量的影響沒有顯著差異，在16 h內(nèi)有明顯的降解(在10%以內(nèi))，16 h后直至7 d內(nèi)，維生素B1衍生產(chǎn)物含量趨于穩(wěn)定。