應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)短喙矮小綜合征鵝細(xì)小病毒

王 劭，肖世峰，林 甦，程曉霞，俞 博，江丹丹，林鋒強(qiáng)，朱小麗，陳仕龍，陳少鶯*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013；3.福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002)

2015年以來，在中國(guó)大陸南方半番鴨與櫻桃谷鴨群中暴發(fā)以生長(zhǎng)障礙、短喙、舌頭外露、易骨析為主要臨床特征的鴨短喙矮小綜合征(Short beak and dwarfism syndrome，SBDS)[1-2]，該病最早由 Villatte報(bào)道在法國(guó)半番鴨群中流行，2009年P(guān)alya分離鑒定了一株鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus，GPV)變異株，命名為短喙矮小綜合征鵝細(xì)小病毒(Short beak and dwarfism syndrome viruse，SBDS-GPV)[3]。SBDSGPV與德茲西氏病 GPV(Derzsy's disease virus，DD-GPV)以及番鴨細(xì)小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)均為細(xì)小病毒科依賴病毒屬成員，是泛組織嗜性單鏈DNA病毒[3]，病毒基因組中間為編碼區(qū)存在兩個(gè)開放閱讀框，依次為Rep基因和VP基因，編碼區(qū)兩側(cè)是包含有倒置末端重復(fù)序列的非編碼區(qū)(UTR)。SBDS-GPV與DD-GPV分離株密切相關(guān)，全基因組核苷酸序列同源性達(dá)87%～94%，與MDPV分離株的序列同源性為83%～84%[4-7]。

GPV目前只有一個(gè)血清型，國(guó)內(nèi)外已有櫻桃谷鴨隱性感染SBDS-GPV造成病毒傳播擴(kuò)散以及北京鴨群中存在隱性感染水禽細(xì)小病毒個(gè)體的報(bào)道[6,8]。隨著水禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，番鴨“三周病”(MDPV感染)、德茲西氏病(俗稱小鵝瘟)與短喙矮小綜合征已經(jīng)成為危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的三大細(xì)小病毒病。目前，防控SBDS的疫苗研究尚停留在實(shí)驗(yàn)室階段，因此加大對(duì)SBDS-GPV特異性的實(shí)驗(yàn)室診斷和分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，對(duì)于水禽SBDS的防控是十分重要的。

本研究根據(jù)SBDS-GPV、DD-GPV和MDPV的5'-UTR基因序列特征，建立僅需1對(duì)PCR引物并結(jié)合快速SspⅠ酶切即可對(duì)SBDS-GPV進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)鑒別檢測(cè)，為進(jìn)一步開展SBDS-GPV的流行病學(xué)調(diào)查提供新的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 病毒株、病料樣品及SPF鴨胚SBDS-GPV M15株、DD-GPV FJ株、MDPV P株、番鴨呼腸孤病毒(MDRV)、新型鴨呼腸孤病毒(NDRV)、鴨副黏病毒(DPMV)、禽流感病毒H9(AIV-H9)和鴨坦布蘇病毒(DTMUV)的cDNA均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物病毒室分離鑒定并保存；14份肝臟病料樣品來自福建省福州、漳州、漳浦等地半番鴨以及櫻桃谷鴨養(yǎng)殖場(chǎng)疑似SBDS病例。9日齡SPF鴨胚購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自行孵化。

1.2 主要試劑細(xì)胞、組織與血液DNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；FastDigestSspⅠ購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；50 bp DNA Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Q5超保真2×Master Mix與PCR克隆試劑盒購(gòu)自美國(guó)NEB公司；DNA回收純化試劑盒E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit購(gòu)自美國(guó)Omega公司。

1.3 酶切位點(diǎn)的選擇及引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中登錄的水禽細(xì)小病毒代表株SBDS-GPV M15株(KU844283)與 DD-GPV FJ 株(KY511292)、MDPV P株(KU844282)全基因組序列，利用Webcuter 2.0軟件(http://rna.lundberg.gu.se/cutter2)對(duì)其核苷酸序列中限制性內(nèi)切酶圖譜進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，SBDSGPV在 5'-UTR基因382～387位核苷酸序列為AATATT，存在1處SspⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)，而DD-GPV與MDPV在5'-UTR基因序列中不存在SspⅠ酶切位點(diǎn)。采用設(shè)計(jì)軟件Oligo 6.0設(shè)計(jì)一對(duì)跨過SspⅠ限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)差異區(qū)的水禽細(xì)小病毒通用引物，序列分別為：SBDS-F1：5'-TCCCCTGATTGGC TGGCTCG-3'/SBDS-R1：5'-AAATCTGAAGAGGCCT AGAAAG-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為200 bp。

1.4 病毒核酸的提取取 200 μL SBDS-GPV(或MDPV、DD-GPV)的尿囊液，根據(jù)試劑盒操作說明書提取其DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR-RFLP方法的建立

1.5.1 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定分別以SBDS-GPV M15、DD-GPV FJ與MDPV P株DNA為模板，采用25 μL 體系：Q5 High-Fidelity 2×Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各 0.5 μL，模板 2 μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足至 25 μL。PCR反應(yīng)條件為 ：98℃10 s；98℃ 10 s、53℃ 20 s、72℃ 30 s，共 30個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。回收純化SBDS-GPV M15、DD-GPV FJ與MDPV P株的PCR產(chǎn)物，克隆至pMiniTM載體，克隆和測(cè)序由寶生物工程(大連)有限公司完成，并用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5.2 RFLP分析利用FastDigestSspⅠ對(duì)SBDSGPV、DD-GPV與MDPV的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5.3 特異性試驗(yàn)按1.5.1與1.5.2所述的SBDSGPV PCR-RFLP方法對(duì) MDRV、NDRV、DPMV、AIV-H9、DTMUV以及正常番鴨胚成纖維細(xì)胞(MDEF)和正常番鴨胚尿囊液進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證其特異性。

1.5.4 敏感性試驗(yàn)將已知含量的SBDS-GPV M15 DNA 進(jìn)行 10-1～10-6倍比稀釋成 50 ng/μL、5 ng/μL、500 pg/μL、 50 pg/μL、 5 pg/μL、 0.5 pg/μL， 進(jìn) 行PCR-RFLP檢測(cè)，觀察結(jié)果，確定其最低檢測(cè)量。

1.5.5 重復(fù)性試驗(yàn)按照已建立的SBDS-GPV PCR-RFLP反應(yīng)條件，以SBDS-GPV M15分離株DNA為模板，重復(fù)3次PCR及RFLP，檢測(cè)方法同1.5.1與 1.5.2。

1.6 臨床樣品的檢測(cè)利用本研究建立的PCR-RFLP方法，對(duì)臨床采集的14份疑似SBDS半番鴨、櫻桃谷鴨肝臟病料樣品進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其感染的水禽細(xì)小病毒進(jìn)行鑒別診斷，同時(shí)參照文獻(xiàn)[7]方法對(duì)PCR-RFLP鑒定為SBDS-GPV陽(yáng)性的肝臟樣品進(jìn)行病毒分離。

2 結(jié)果

2.1 病毒PC R產(chǎn)物的鑒定分別將SBDS-GPV M15、DD-GPV FJ與MDPV P分離株的PCR產(chǎn)物克隆至pMiniTM載體中。測(cè)序顯示，擴(kuò)增片段序列與SBDS-GPV M15、DD-GPV FJ與 MDPV P 5'UTR相應(yīng)核苷酸序列100%相符，表明SBDS-F1/R1引物組擴(kuò)增出的病毒PCR片段特異性良好。

2.2 SBDS-GPV M15、DD-GPV FJ和 MDPV P分離株的PCR-RFLP結(jié)果利用設(shè)計(jì)的特異性引物SBDS-F1/SBDS-R1對(duì) SBDS-GPV M15、DD-GPV FJ和MDPV P PCR擴(kuò)增后，得到的目的條帶大小均為200 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng) FastDigestSspⅠ酶切后顯示，SBDS-GPV M15 PCR產(chǎn)物被切為兩段，大小為 140 bp和60 bp；而DD-GPV FJ和 MDPV P PCR產(chǎn)物不能被SspⅠ酶切(圖 1)。PCR-RFLP分析結(jié)果表明水禽細(xì)小病毒基因組5'-UTR基因序列中SspⅠ酶切位點(diǎn)的差異可以做為鑒定SBDS-GPV的標(biāo)志，在基因水平上能夠?qū)BDS-GPV與DD-GPV、MDPV區(qū)分。

圖1 SBDS-GPV、DD-GPV和MDPV 5'-UTR基因的PCR-RFLP分析Fig.1 Analysis of 5'-UTR genes of SBDS-GPV,DD-GPV and MDPV by PCR-RFLP

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)SBDS-GPV、MDRV、NDRV、DPMV、AIV-H9、DTMUV各病毒cDNA進(jìn)行PCR-RFLP擴(kuò)增及酶切，結(jié)果僅SBDS-GPV PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切出140 bp和60 bp的目的條帶，其余病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均無(wú)條帶出現(xiàn)(圖2)。表明該方法特異性良好。

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果采用建立的SBDS-GPV PCR-RFLP方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，10-5倍稀釋的SBDS-GPV核酸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物仍能出現(xiàn)兩條酶切片段，且最低檢測(cè) DNA濃度為 2.28×107拷貝 /μL(圖3)。表明該方法敏感性高。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) SBDS-GPV PCR-RFLP重復(fù)3次，結(jié)果PCR產(chǎn)物在140 bp和60 bp處，均得到了清晰可見的目的條帶。表明該方法的重復(fù)性好。

圖2 SBDS-GPV PCR-RFLP的特異性分析Fig.2 The specific tests of the SBDS-GPV PCR-RFLP

圖3 SBDS-GPV PCR-RFLP敏感性分析Fig.3 The sensitivity test of the PCR-RFLP detection for SBDS-GPV

2.6 臨床樣本檢測(cè)采用建立的PCR-RFLP方法對(duì)14例疑似SBDS的櫻桃谷鴨、半番鴨肝臟樣品進(jìn)行了檢測(cè)。經(jīng)PCR-RFLP分析后發(fā)現(xiàn)，8份半番鴨病料(樣品號(hào) 6、7、8、10、11、12、13 和 14)和 4 份櫻桃谷北京鴨病料樣品(樣品15、17、18和19)確診為 SBDS-GPV感染(圖 4)。對(duì) 12份 PCR-RFLP檢測(cè)為陽(yáng)性的肝臟病料樣品進(jìn)行病毒分離，分離病毒在傳至4代后能夠引起SPF鴨胚死亡，死亡SPF鴨胚尿囊液經(jīng)PCR-RFLP檢測(cè)顯示所含病毒均為SBDSGPV(圖 5)。表明在臨床調(diào)查分析疑似水禽細(xì)小病毒感染病例過程中，本研究建立的PCR-RFLP方法能夠保證SBDS-GPV檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

圖4 部分臨床樣品的PCR-RFLP分析結(jié)果Fig.4 Analysis of clinical samples by the PCR-RFLP

圖5 12份SBDS-GPV陽(yáng)性病毒的PCR-RFLP分析結(jié)果Fig.5 Analysis of 12 SBDS-GPV isolates by the PCR-RFLP

3 討論

SBDS在中國(guó)大陸暴發(fā)并流行以來，一直受到水禽養(yǎng)殖業(yè)者與科研人員的高度關(guān)注，在獸醫(yī)臨床中急需開展針對(duì)該病流行病學(xué)調(diào)查的技術(shù)規(guī)程。雖然目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有多種關(guān)于GPV分子生物學(xué)檢測(cè)方法的報(bào)道，如PCR、熒光定量PCR、PCR-LAMP等[9-10]，但由于水禽細(xì)小病毒不同分離株基因組編碼區(qū)核苷酸序列同源性高，PCR引物特異性不強(qiáng)，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果；因此鑒別SBDS-GPV基因特征的方法還是主要依據(jù)病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的核苷酸序列測(cè)定分析，然而在基層日常檢測(cè)工作中，針對(duì)大量臨床感染樣本的進(jìn)行測(cè)序存在成本高、操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，不適用于疫病的快速鑒別診斷。

RFLP是指由限制性酶切位點(diǎn)間的插入、缺失、重排或點(diǎn)突變所引起的基因型間限制性片段長(zhǎng)度的變異。本研究在分析水禽細(xì)小病毒基因組序列的基礎(chǔ)上，利用SBDS-GPV與DD-GPV、MDPV在5'-UTR基因SspⅠ酶切位點(diǎn)的差異，將PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)組合起來，建立了可快速鑒別SBDS-GPV的PCR-RFLP方法，PCR產(chǎn)物預(yù)期片段為200 bp，SBDS-GPV的PCR產(chǎn)物能被SspⅠ酶切為140 bp和60 bp兩個(gè)片段，而DD-GPV與MDPV的PCR產(chǎn)物不能被SspⅠ酶切；通過對(duì)14份疑似SBDS病料樣品檢測(cè)對(duì)建立的PCR-RFLP方法進(jìn)行應(yīng)用評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示該P(yáng)CR-RFLP方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)SBDS-GPV。本研究建立的SBDS-GPV PCR-RFLP方法不但有效避免了假陽(yáng)性，而且檢測(cè)出的最低SBDS-GPV DNA濃度為5 pg/μL，具有較高的特異性和敏感性。有利于基層實(shí)驗(yàn)室通過檢測(cè)疑似SBDS水禽組織病料來評(píng)估SBDS-GPV感染狀況，并及時(shí)掌握自然條件下水禽感染SBDS-GPV的分布情況，可以作為SBDS凈化的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，也為開展GPV流行病學(xué)調(diào)查中研究SBDS-GPV傳播途徑提供了新的研究手段。