澳洲龍紋斑源致病菌嗜水氣單胞菌TPF-2的分離鑒定及藥敏特性研究

羅土炎，饒秋華，劉 洋，張志燈，羅 欽，陳美珍，任麗花，黃敏敏，翁伯琦

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，福建 福州350003；2.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建 福州 350003；3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福建 福州 350003)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)隸屬弧菌科氣單胞菌屬，廣泛存在于淡水、海水、土壤、魚類和脊椎動(dòng)物腸道中，是一種典型的人獸共患條件致病菌，尤其是水生動(dòng)物常見(jiàn)的致病菌之一[1]。其可導(dǎo)致多種水生動(dòng)物表現(xiàn)出不同臨床癥狀，如肌肉和內(nèi)臟出血、爛鰓、壞死、腹部膨脹、水腫等[2-3]；另外，因其常與其它致病菌混合感染使得病情加重，從而給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害，已引起人們的廣泛關(guān)注[4]。

澳洲龍紋斑(Maccullochella peelii peelii)又名墨瑞鱈(murray cod)、鱈鱸、澳洲淡水鱈鱸等， 2001年開始引進(jìn)中國(guó)大陸進(jìn)行人工繁育和高密度養(yǎng)殖，然而2015年9月浙江省衢州市某設(shè)施養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)澳洲龍紋斑出現(xiàn)腹部腫大，爛尾，部分養(yǎng)殖池出現(xiàn)大量死亡，死亡率達(dá)65%。剖檢發(fā)現(xiàn)魚腹中有淡紅色腹水，肝臟、腎臟等實(shí)質(zhì)性器官出現(xiàn)充血、腫大，后腸充血糜爛，肌肉有針尖狀出血點(diǎn)。本研究從患病澳洲龍紋斑中分離到1優(yōu)勢(shì)菌株，命名為TPF-2，通過(guò)回歸試驗(yàn)確定其為病原菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征和基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析對(duì)該菌進(jìn)行了分類鑒定，并通過(guò)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)了該菌株對(duì)各類藥物的敏感性，為澳洲龍紋斑源嗜水氣單胞菌病的流行病學(xué)和耐藥性等研究提供依據(jù)，同時(shí)為該病的防控提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料患病澳洲龍紋斑來(lái)源于浙江衢州某澳洲龍紋斑設(shè)施養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量1.0 kg～1.5 kg，體長(zhǎng)22 cm～29 cm。健康澳洲龍紋斑來(lái)源于同一養(yǎng)殖基地，體質(zhì)量0.5 kg～1.0 kg，體長(zhǎng)15 cm～22 cm，在水溫20℃～22℃、溶氧8.23 mg/L的塑料圓桶內(nèi)(直徑為5 m，水深為0.6 m)暫養(yǎng)10 d，觀察期間無(wú)發(fā)病和死亡后用于感染試驗(yàn)。

BHI(BD，BectoTMBrain Heart Infusion)購(gòu)自 BD中國(guó)代理機(jī)構(gòu)；LB液體培養(yǎng)基，哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(5%脫脂綿羊血)購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；API全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(型號(hào)：VITEK 2 COMPACT 30)及相關(guān)試劑均購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)中所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 病原菌的分離和培養(yǎng)選取具有典型癥狀的患病澳洲龍紋斑，用75%的酒精對(duì)病魚進(jìn)行體表消毒，在生物安全柜無(wú)菌取其肝臟、腎臟和腹水等病灶組織，經(jīng)勻漿粉碎后涂布于BHI瓊脂培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)48 h后，選取平板上形態(tài)顏色一致且最多的菌落，挑取單菌落劃線純化培養(yǎng)，最后轉(zhuǎn)移到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后于16%的甘油中(-80℃)保存，菌株命名為TPF-2。同時(shí)對(duì)該菌進(jìn)行溶血試驗(yàn)和電鏡觀察。

1.3 分離菌16S rRNA基因擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建將純化后的菌株TPF-2接種于BHI液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h后12 000 r/min離心收集菌體，參照試劑盒說(shuō)明書提取其基因組DNA。利用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增16S rRNA基因序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后對(duì)目的條帶回收純化，送由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司(福州測(cè)序部)進(jìn)行基因序列測(cè)定。

從Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)中選取30個(gè)與菌株TPF-2最相似菌株的16S rRNA基因序列，利用cluster W進(jìn)行比對(duì)，用MEGA7軟件包中的Neighbor-Joining法構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過(guò)1000次Bootstrap檢驗(yàn)置信度。

1.4 分離菌的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定參照KOH拉絲法對(duì)菌株TPF-2進(jìn)行革蘭氏鑒定，同時(shí)利用API全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對(duì)分離菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.5 分離菌的人工感染試驗(yàn)為確定該菌株是否對(duì)澳洲龍紋斑具有致病性，選取同一養(yǎng)殖基地的健康澳洲龍紋斑作為感染對(duì)象，設(shè)1個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組30尾。經(jīng)腹鰭基部每尾注射0.2 mL(4.0×109cfu/mL)菌懸液，對(duì)照組注射相同劑量的無(wú)菌PBS。每天觀察其發(fā)病癥狀并記錄死亡情況，連續(xù)觀察10 d。在澳洲龍紋斑出現(xiàn)瀕死癥狀時(shí)取其內(nèi)臟組織進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)與鑒定，以確定菌株TPF-2的致病性。

1.6 分離菌的藥物敏感試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所的藥敏試驗(yàn)指南[5]的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離及形態(tài)觀察從患病澳洲龍紋斑肝、脾臟和腹水中分離到同一株優(yōu)勢(shì)菌TPF-2。該菌在BHI固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，經(jīng)過(guò)28℃培養(yǎng)24 h后形成直徑為1 mm～2 mm、光滑、不規(guī)則圓形、隆起、淡黃色菌落。電鏡觀察可見(jiàn)菌株TPF-2長(zhǎng) 0.98 μm～2.96 μm，寬 0.79 μm～0.86 μm，極生單鞭毛(圖 1)。在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(5%脫脂綿羊血)上可產(chǎn)生明顯的β-溶血圈(圖 2)。

圖1 菌株TPF-2在透射電子顯微鏡(A)和掃描電子顯微鏡(B)下的形態(tài)特征Fig.1 The morphology of strain TPF-2 under transmission electron micrograph(A)and scanning electron microscope(B)

圖2 菌株TPF-2在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生β-溶血圈Fig.2 β-Hemolysis of strain TPF-2 on the Columbia blood agar medium

2.2 16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建利用Sanger法對(duì)從菌株TPF-2 PCR擴(kuò)增的16S rRNA基因序列進(jìn)行測(cè)序，得到1 412 bp DNA序列(GenBank序列號(hào)為MH133035)。將該基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，顯示其屬于氣單胞菌屬(Aeromonas)，16S rRNA基因序列與Aeromonas hydrophilasubsp.hydrophilaATCC 7966T和Aeromonas hydrophilasubsp.RanaeLMG 19707T相似度最高，分別為99.9%和99.8%?；?6S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹顯示菌株TPF-2與Aeromonas hydrophilasubsp.hydrophilaATCC 7966T，Aeromonas hydrophilasubsp.RanaeLMG 19707T和Aeromonas mediaCECT 4232T聚集到同一分支(圖3)。進(jìn)一步表明該菌株隸屬于氣單胞菌屬，與Aeromonas hydrophila和Aeromonas media具有較近的親緣關(guān)系。

2.3 分離菌的形態(tài)學(xué)生理生化特征KOH拉絲法鑒定結(jié)果顯示，TPF-2菌懸液無(wú)拉絲現(xiàn)象，表明TPF-2菌株為革蘭氏陰性菌。 API全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定結(jié)果顯示，菌株TPF-2為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，其它生化譜如表1所示，置信度極好。以上結(jié)果進(jìn)一步表明該菌為氣單胞菌。

2.4 人工感染試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組澳洲龍紋斑在腹鰭基部接種感染初期，表現(xiàn)為食欲廢絕，無(wú)力游動(dòng)，腹部貼于池底，24 h后魚群發(fā)病占實(shí)驗(yàn)組總數(shù)30%且出現(xiàn)死亡，10 d內(nèi)累計(jì)死亡率為56.7%，PBS對(duì)照組試驗(yàn)期間未出現(xiàn)死亡，存活曲線結(jié)果如圖4所示。剖檢患病或死亡病魚肝臟、腎臟腫脹充血，腸壁充血，與自然發(fā)病澳洲龍紋斑病變相似。同時(shí)，從感染死亡魚體的肝臟內(nèi)再次分離到嗜水氣單胞菌，其形態(tài)、生理生化特征與菌株TPF-2一致，表明菌株TPF-2是澳洲龍紋斑患病的病原菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株TPF-2對(duì)先鋒必素、菌必治、硫酸鋅霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、恩諾沙星6種藥物敏感；對(duì)紅霉素1種藥物中度敏感；對(duì)卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明3種藥物介于敏感和中度敏感之間；對(duì)利福平1種藥物介于中度敏感和耐藥之間；對(duì)氨芐青霉素、多西環(huán)素、磺胺異惡唑等10種藥物耐藥(表2)。

圖3 分離菌的形態(tài)學(xué)基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹、(鄰近法)Fig.3 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of strain TPF-2

表1 分離菌生理生化鑒定結(jié)果(GN卡)Table 1 Identification of the isolate by API automatic Microbial Identification System(GN card)

3 討論

圖4 菌株TPF-2的人工感染試驗(yàn)Fig.4 Pathogenicity test of the isolate in fish by artificial infection

澳洲龍紋斑是一種大型肉食性魚類，原產(chǎn)于澳大利亞墨瑞河(Murray-Darling)流域，由于過(guò)度捕撈，河道治理以及生境退化等原因，現(xiàn)澳洲龍紋斑在國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄中，被列為極度瀕危(IUCN 2.3)物種，排名前于中國(guó)大熊貓。隨著澳洲龍紋斑野外種群數(shù)量急劇下降，人工養(yǎng)殖已經(jīng)成為物種延續(xù)最為重要的途徑。澳洲龍紋斑被引入國(guó)內(nèi)之后，先后取得了人工繁育、規(guī)模化培育技術(shù)、高密度工廠化養(yǎng)殖技術(shù)等的突破，人工種群蓄養(yǎng)形成了一定的規(guī)模。對(duì)開展澳洲龍紋斑規(guī)?；B(yǎng)殖，增加人們的健康營(yíng)養(yǎng)的餐桌食品以及物種延續(xù)具有重要意義。然而在澳洲龍紋斑人工養(yǎng)殖的過(guò)程中，存在養(yǎng)殖密度大、人工餌料營(yíng)養(yǎng)不平衡、餌料中致病菌等影響因素。由于澳洲龍紋斑在國(guó)內(nèi)人工養(yǎng)殖歷史較短，對(duì)其細(xì)菌性病害的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究從患病澳洲龍紋斑病灶組織中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，可復(fù)制與其自然發(fā)病相似的癥狀，死亡率為56.7%，且從人工感染患病的澳洲龍紋斑病灶中再次分離到相同的病原菌，證實(shí)其為導(dǎo)致澳洲龍紋斑發(fā)病的病原菌。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征以及16S rRNA基因序列分析，確定該菌株為嗜水氣單胞菌。

嗜水氣單胞菌的致病范圍極其廣泛，可以感染淡水魚類、蛙類、鱉類及包括人在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物[6-7]。被感染的淡水魚類由于種類不同臨床表現(xiàn)也略有不同，例如鱘魚出現(xiàn)眼周、硬鱗基部等體表出血，肝臟、腎臟等實(shí)質(zhì)性器官出現(xiàn)不同程度的出血、充血[8-9]；羅非魚病魚魚體發(fā)黑，體側(cè)部分鱗片脫落，背部及尾部鰭條腐爛，肝臟充血糜爛[10]；團(tuán)頭魴病魚體表出血，肝臟和膽囊腫大，體腔伴有黃色粘液[11]。受感染的中華鱉可發(fā)生紅脖子病、白底病、腐皮病等多種細(xì)菌性疾病[12]。人類感染食源性嗜水氣單胞菌出現(xiàn)腹痛、腹瀉，并伴有嘔吐等癥狀[13]。本研究中患病澳洲龍紋斑肝臟、腎臟等多個(gè)器官出現(xiàn)腫大充血等癥狀，與嗜水氣單胞菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病癥狀相近，充血后導(dǎo)致器官功能發(fā)生障礙，這可能是引起病魚死亡的主要原因。菌株TPF-2具有溶血現(xiàn)象，可能含有相關(guān)的溶血毒素，與觀察到的癥狀相符。

表2 菌株TPF-2對(duì)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Antibiotic susceptibility test of the strain TPF-2

有效、合理使用抗生素是防治魚類細(xì)菌性疾病的重要措施之一。藥敏試驗(yàn)顯示，菌株TPF-2對(duì)先鋒必素、菌必治、硫酸鋅霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、恩諾沙星6種藥物敏感，與夏飛[11]等對(duì)團(tuán)頭魴分離的嗜水氣單胞菌藥敏結(jié)果相似。但對(duì)四環(huán)素類、除復(fù)方新諾明外的多種磺胺類、多粘菌素、青霉素等抗生素耐藥，表現(xiàn)出多重耐藥性。對(duì)四環(huán)素類及除復(fù)方新諾明外的多種磺胺類耐藥與隋慧[14]等報(bào)道的嗜水氣單胞菌對(duì)四環(huán)素類和磺胺類藥物敏感不相符，表明其對(duì)四環(huán)素類及磺胺類藥物產(chǎn)生了明顯的耐藥性。造成該現(xiàn)象的原因包括兩方面，一方面可能是在養(yǎng)殖過(guò)程中長(zhǎng)期或大量使用該類藥物所造成的耐藥，另一方面是該菌株對(duì)這些藥物本身就耐藥[15]；同時(shí)，產(chǎn)生藥敏差異也可能是由于不同區(qū)域、不同水域環(huán)境中的菌株受不同藥物環(huán)境作用影響而產(chǎn)生耐藥性變異[16]，因此在實(shí)際生產(chǎn)中要使用敏感性抗菌藥物進(jìn)行治療，預(yù)防耐藥性菌株的產(chǎn)生，同時(shí)積極改善養(yǎng)殖水體環(huán)境，增強(qiáng)魚體抵抗力。

澳洲龍紋斑作為新興產(chǎn)業(yè)剛剛起步，還未見(jiàn)關(guān)于其感染嗜水氣單胞菌的報(bào)道，但隨著工廠化養(yǎng)殖的發(fā)展，其養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的發(fā)病也呈不斷上升趨勢(shì)，主要疾病的發(fā)現(xiàn)及防治已成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。本研究為澳洲龍紋斑嗜水氣單胞菌病害的防治和其高密度循環(huán)水健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。