黏附與聚集、抗腫瘤及抗菌特性乳桿菌的篩選

宋雨心，王文騫，張 園，劉琳琳，王婷婷，祁小樂，高玉龍，王永強，高宏雷，李 凱，劉長軍，張艷萍，高 立，王笑梅*，崔紅玉*，何高明

(1.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832002；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/禽免疫抑制病創(chuàng)新團隊，黑龍江哈爾濱150069)

益生菌廣泛分布于自然界中，被定義為“足夠量可給予機體健康益處的微生物”(FAO/WHO，2009)，它們大多是可利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸、安全無毒、無致病性、無致癌性的一類革蘭氏陽性細菌，在世界范圍內(nèi)被公認為“GRAS”級(食品安全級)的微生物[1-2]。益生乳酸菌能夠促進腸道微生物群落的生態(tài)平衡、控制內(nèi)毒素、抑制腸道病原體如大腸桿菌、沙門氏菌等；調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)，影響宿主健康等[3-4]。李平蘭等的研究表明，來自豬和人類糞便的不同種類乳酸菌在體外與人結(jié)腸癌細胞系HT-29細胞的黏附能力不同，而HT-29細胞在體外易培養(yǎng)，其形態(tài)、黏附能力等與腸上皮細胞類似，能表達正常人腸細胞的形態(tài)和某些生理特性，所以常被用于黏附實驗[5]。黏附是指細菌與腸上皮細胞通過生物化學作用產(chǎn)生的特異性粘連。乳酸菌對腸道上皮細胞的黏附作用有助于其在腸道定植、增強乳酸菌與腸道細胞之間的信號交流和提高機體的免疫力，因此乳酸菌的黏附特性是評價其是否具有良好調(diào)節(jié)免疫功能的重要指標，是影響活菌制劑效果的關(guān)鍵因素之一[6-7]。目前抗生素被廣泛用于飼料添加劑來預防疾病，促進動物機體生長，降低其死亡率。但隨著抗生素的濫用造成的細菌耐藥性、藥物殘留等問題日益突出，嚴重危害人類健康。因此，尋找能代替抗生素的天然物質(zhì)刻不容緩，有研究者指出，益生菌可作為最佳的替代品之一，具有增強宿主抵抗力、提高機體健康水平、減少疾病發(fā)生等優(yōu)點[2]。

本研究以10株乳桿菌為研究對象，研究了乳桿菌黏附腸道細胞與抗腸道腫瘤增殖及抗腸道致病菌的作用，篩選出具有強黏附特性及抗腸道腫瘤、抗腸道致病菌的乳桿菌，為活菌制劑的選擇、抗腫瘤制劑及替代抗生素制劑等的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與細胞10株乳桿菌(表1)由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所益生菌種資源庫-80℃保存，均為天然健康(非人工飼養(yǎng))動物腸道中分離，經(jīng)過耐酸(pH3.0)、耐膽鹽(0.3%)實驗篩選和動物飼喂實驗驗證的益生菌株。標準致病菌株大腸埃希氏菌ATCC25922(Escherichia coliATCC25922)、雞白痢沙門氏菌 CVCC578(Salmonella pullorumCVCC578)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC 25923)均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；人結(jié)直腸腺癌細胞系(HT-29細胞)由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存。

表1 10株候選乳桿菌菌株Table 1 10 strains of candidate Lactobacillus

1.2 主要試劑MRS培養(yǎng)基購自青島海博生物科技有限公司；LB培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；100×青-鏈霉素、0.25%胰酶-EDTA、磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)、臺盼藍、4%多聚甲醛購自Life Technologies公司；TaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司；4',6-二脒基 -2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、羧基熒光素雙乙酸鹽-琥珀酰亞胺酯(carboxy fluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)購自Sigma公司。

1.3 乳桿菌的培養(yǎng)及菌懸液的制備乳桿菌菌種按1%體積接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)18 h后傳代，傳代培養(yǎng)3次后備用；標準致病菌按1%接種于LB液體培養(yǎng)基，于37℃ 200 r/min搖床中培養(yǎng)18 h備用；離心收集菌體(5 000 r/min，4℃，10 min)，PBS洗滌3次，將菌體用PBS重懸，調(diào)整細菌懸液的 OD600nm值至 1±0.05(約為 2×108cfu/mL)備用。

1.4 乳桿菌自聚集能力測試根據(jù)Polak-Berecka[8]等和Kos[9]等文獻進行自聚集測定：取5 mL 1.3所獲得的細菌懸浮液渦旋10 s，并在37℃下靜止孵育2 h，測量上清液的OD600nm值。根據(jù)下列公式1計算細菌的自聚集率(Ac%)：

公式 1： AC(%)=[1-(A2h/A0)]×100

其中，A0是細菌懸浮液渦旋后測定的初始OD600nm值；A2h是靜止孵育2 h后細菌懸液上清的OD600nm值。

1.5 乳桿菌與致病性細菌的共聚集能力測試根據(jù)Xu[10]等文獻進行共聚集測定：乳桿菌、標準致病菌菌懸液各取2 mL(2×108cfu/mL)等體積混合，渦旋10 s，并在37℃下靜止孵育2 h，每個離心管總體積為4 mL。2 h后測定上清液OD600nm值，并根據(jù)公式2計算共聚集率(Cc%)：

公式 2：CC(%)=[1-COmix/(COstrain+COpathogen)/2]×100

其中，COmix是混合物培養(yǎng) 2 h后的 OD600nm值，COstrain是乳桿菌的初始光密度OD600nm值，COpathogen是標準致病菌的初始OD600nm值。

1.6 乳桿菌黏附能力的測定HT-29細胞2 d更換一次培養(yǎng)液，3 d進行傳代，傳代5次后進行后續(xù)試驗。根據(jù) Zhang[11]等、Duary[12]等和劉東方[6]等的方法進行了改進：將 HT-29細胞以 2×105個 /孔的密度分別接種于6孔板、12孔板中，隔天更換培養(yǎng)液，待其生長至70%～80%進行實驗。用PBS(pH7.4)清洗6孔板中的細胞兩次。取1 mL乳桿菌菌懸液(OD600nm=1.0，2×108cfu/mL)經(jīng) 4 000 r/min，離心10 min，用無菌PBS清洗3次后加入1 mL 50 μmol/L的羧基熒光素雙乙酸鹽-琥珀酰亞胺酯(Carboxy-fluorescein diacetate， succinimidyl ester， CFSE)溶 液 ，于37℃搖床避光培養(yǎng)20 min將細菌著色，隨后4 000 r/min，離心10 min收集菌體，用無菌的PBS清洗3次后使用2 mL無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸菌體。每孔加入1 mL菌懸液，將6孔板于37℃，5%CO2培養(yǎng)2 h。將所有孔用無菌PBS洗滌4次，并用4%多聚甲醛固定30 min。PBS清洗后，加入0.1%Triton X-100，靜置10 min。最后，使用DAPI染細胞核，倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7 乳桿菌內(nèi)化能力的測定根據(jù)Cirillo[13]等方法進行改進：用PBS清洗接種于12孔板且生長至70%～80%的HT-29細胞兩次，取1 mL乳酸菌懸液(OD600nm=1.0，2×108cfu/mL)，每孔按 MOI為 1 000∶1(細菌與細胞數(shù)量的比值)加入細胞培養(yǎng)板中，于37℃，5%CO2共培養(yǎng) 2 h。PBS洗滌細胞 3～4次，除去未黏附的細菌，加入150 μg/mL慶大霉素作用 1 h，每孔加入 0.25%胰酶靜置 3 min，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化反應。然后加入0.5%Triton-X100，靜置5 min。最后將混合物經(jīng)一系列10倍連續(xù)稀釋，接種于固體MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h～48 h后進行平板計數(shù)。根據(jù)公式計算內(nèi)化率：

1.8 乳桿菌抗HT-29細胞增殖能力的檢測根據(jù)文獻[14-15]，以CCK8試劑盒測定乳桿菌對人結(jié)直腸腺癌細胞的抗增殖作用。將濃度為2×104個/100 μL的HT-29細胞接種于96孔板中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h后用PBS洗滌細胞2次，每個孔按MOI為100∶1加入OD600nm為1.0的乳酸菌懸液，于37℃5%CO2培養(yǎng)16 h后臺盼藍法檢查細胞活力，每孔加入10 μL CCK8試劑，培養(yǎng)4 h后測定OD450nm。根據(jù)公式計算細胞增殖百分比：

細胞增殖(%)=[(Ates-Acontrol)/Acontrol]×100

其中Atest為與乳桿菌相互作用的HT-29細胞孔的 OD450nm；Acontrol為僅 HT-29細胞孔的 OD450nm。

1.9 乳桿菌的體外抗菌活性乳桿菌按1%體積接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，作為待測菌液。將培養(yǎng)18 h的指示菌按0.2%接種于約50℃熔化的LB瓊脂培養(yǎng)基中，混合均勻，倒入預先放有牛津杯的培養(yǎng)皿中待其凝固后，取出牛津杯，在每個牛津杯孔中加入200 μL待測乳桿菌培養(yǎng)液，于37℃培養(yǎng)48 h，用游標卡尺測量抑菌環(huán)大小。

2 結(jié)果

2.1 乳桿菌自聚集能力檢測結(jié)果對10種乳桿菌進行自聚集能力檢測，結(jié)果顯示，Lac.97菌株具有最強的自聚合能力，達到67.73%，顯著高于其它菌株(p＜0.0001)，其次是 Lac.95、Lac.71、和 Lac.99菌，自聚合能力分別為41.84%、32.48%和26.93%。候選菌株 Lac.95、Lac.97、Lac.99、Lac.56、Lac.71、Lac.85等6株乳桿菌的自聚合能力均達到20%以上(圖 1)。

圖1 10株乳桿菌自聚集能力分析Fig.1 Analysis of auto-aggregation ability of the 10 strains Lactobacillus

2.2 乳桿菌與致病菌的共聚集能力檢測結(jié)果10株候選菌株與致病菌共聚合能力測試，結(jié)果顯示10株乳桿菌與致病性大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌的共聚集能力均較強，均達到80%以上(圖2)。表明本試驗中的10株乳桿菌均可共聚集致病菌。

圖2 10株乳桿菌與致病菌的共聚集能力比較Fig.2 Comparison of co-aggregation ability between 10 Lactobacillus strains with the pathogenic bacteria

2.3 乳桿菌體外黏附上皮細胞的觀察將HT-29細胞與CFSE染色的各乳桿菌菌懸液共培養(yǎng)，于熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，Lac.99菌株黏附能力最強，其余乳桿菌株對上皮細胞也具有強度不一的黏附性(圖 3)。表明10株乳桿菌對HT-29細胞均具有黏附能力。

2.4 乳桿菌內(nèi)化腸道上皮細胞結(jié)果根據(jù)平板計數(shù)結(jié)果顯示，菌株Lac.86、Lac.87、Lac.99、Lac.85等4株乳桿菌對HT-29的內(nèi)化率達到5%以上，其中Lac.99菌株內(nèi)化率最高，達到14.85%，顯著高于除Lac.87外的菌株(p＜0.0001)(圖 4)。表明篩選到的Lac.86、Lac.87、Lac.99、Lac.85乳桿菌均具有對腸道上皮細胞較強的內(nèi)化作用。

圖3 乳桿菌Lac.99黏附及內(nèi)化HT-29細胞Fig.3 Observation of Lactobacillus strain lac.99 adhesion and internalization HT-29 cells

圖4 10株乳桿菌的內(nèi)化能力Fig.4 Analysis of the internalization ability of the 10 Lactobacillus stains

2.5 乳桿菌抗人結(jié)直腸腺癌細胞增殖能力的檢測結(jié)果體外試驗結(jié)果顯示，在10種乳桿菌中，Lac.117、Lac.56菌株具有較強的抗腫瘤細胞HT-29增殖的作用，其中作用最強的是Lac.56菌株，達到49.71%，與 Lac.117相比差異顯著(p＜0.05)，而其余乳桿菌菌株對HT-29細胞的增殖影響不明顯，差異不顯著(圖 5)。表明篩選到的乳桿菌株 Lac.117，Lac.56具有較強的抗腫瘤細胞增殖作用。

圖5 10株乳桿菌對HT-29細胞的抗增殖能力Fig.5 The anti-proliferation ability of 10 Lactobacillus strains against HT-29 cells

2.6 乳桿菌體外抑菌活性檢測結(jié)果采用抑菌環(huán)試驗檢測篩選的乳桿菌體外抑菌活性，結(jié)果顯示，10株乳桿菌對致病性大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌及金黃色葡萄球菌均有抑制作用，其中Lac.117菌株對3種致病菌的抑制作用均最強，抑菌環(huán)直徑分別為16 mm、17 mm和 15 mm(表 2)。表明本研究篩選的乳桿菌均具有不等的抑菌活性。

表2 乳桿菌對致病菌的抑制活性Table 2 Inhibition activity of Lactobacillus against pathogenic bacteria

3 討論

據(jù)報道乳酸菌自聚集能力與其黏附能力密切相關(guān)，研究表明自聚集能力強的乳酸菌往往具有較強的黏附腸道上皮細胞的能力，因此測定乳酸菌自聚集能力是篩選其黏附特性的首要指標[16]。只有當乳酸菌黏附于腸上皮細胞表面時，才能定植于腸道上皮細胞表面，有效發(fā)揮其抑制致病菌侵襲腸粘膜的生物屏障的功能[17]。腸道黏膜上皮細胞中、黏膜固有層以及派伊爾氏結(jié)(PP)中分布有許多免疫活性細胞，部分分布在上皮之間，據(jù)相關(guān)研究報道，細菌的黏附和內(nèi)化與這些黏膜免疫細胞密切相關(guān)，乳桿菌的內(nèi)化是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用或運載特定抗原到達效應部位的前提[18-21]。

本研究通過體外腸道上皮細胞模型測試了10株乳桿菌的黏附能力及其抗腫瘤、抗致病菌能力。結(jié)果顯示，10株乳桿菌中，60%的乳桿菌自聚集能力達到20%以上。其中l(wèi)ac.97菌株自聚集能力最強達到67.73%，高于Abbasiliasi[16]等報道的乳桿菌自聚集能力(35.2%)，表明lac.97乳酸菌具有高黏附特性，高黏附特性益生菌的獲得為將來益生菌的抗菌活性研究，以及乳桿菌免疫調(diào)節(jié)劑的研究奠定重要的基礎(chǔ)。通過顯微鏡下觀察10株乳桿菌對腸道HT-29細胞不僅具有黏附性而且可通過細胞膜內(nèi)化進入細胞內(nèi)。lac.97菌株自聚集能力強但內(nèi)化能力較弱，而lac.117菌自聚合能力與lac.97菌相比較低，但lac.117內(nèi)化能力很強，表明自聚集能力與黏附和內(nèi)化能力不一定成正相關(guān)。經(jīng)平板計數(shù)測定Lac.117內(nèi)化率，可達到14.85%，與顯微鏡觀察到的結(jié)果一致，lac.117的內(nèi)化率較Cirillo[13]等報道的乳桿菌的內(nèi)化率更高，提示lac.117可能具有更強的抗原遞送潛力。

此外，本研究通過抑制腫瘤細胞生長和細胞活力來驗證乳桿菌的抗腫瘤作用，結(jié)果顯示lac.117和lac.56乳桿菌對人結(jié)直腸腺癌HT-29細胞的生長均具有較強的抑制作用，其抗增殖能力分別達到27.15%和49.71%，該結(jié)果與Grimoud J[15]描述的一致且抑制能力更強。研究報道乳酸菌抑制病原菌的能力和其與病原菌共聚集能力有關(guān)，本研究顯示10株乳桿菌與病原細菌的的共聚集能力相當[9-10]，差異不顯著，但體外抑菌試驗表明lac.117對致病菌大腸埃希氏菌、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制能力最強。通過比較分析10株乳桿菌的黏附特性、抗致病菌特性和抗腫瘤細胞增殖特性，顯示這些菌株不能同時在所有益生特性指標上表現(xiàn)優(yōu)秀，即不同乳桿菌的益生特性千差萬別，一株益生菌不能同時具有各種益生特性，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致[22]，可能這與它原本的生活環(huán)境、產(chǎn)生不同的副產(chǎn)物、生物特性以及其他因素等有關(guān)，但綜合以上結(jié)果可見Lac.56各方面特性均較好。