車前子多糖抗腫瘤作用的實驗研究

馮 娜，王素敏

(天津市東麗區(qū)東麗醫(yī)院，天津 300300)

多糖是存在于高等植物、真菌、藻類、細(xì)菌和動物細(xì)胞膜上由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子化合物[1]。多糖以其抗腫瘤活性、免疫活性而備受關(guān)注，且毒副作用較小[2]。根據(jù)早期研究發(fā)現(xiàn)，多糖為車前子中主要活性成分之一，該多糖具有整腸通便、降低血脂、調(diào)節(jié)血糖的作用，還具有明顯的抗氧化、清除自由基作用及防治動脈粥樣硬化功能[3]，但在抗腫瘤作用方面研究甚少，本文擬探討車前子多糖的抗腫瘤作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 清潔級昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄不限；清潔級BALB/C雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(冀)2013-1-003，合格證號：804020，均由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。動物飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級環(huán)境，溫度(24±2) ℃，濕度50%～60%。

1.1.2主要試劑 市售車前子采用微波技術(shù)[4]提取車前子多糖，車前子多糖得率為1.84。噻唑藍(lán)(MTT，Sigma公司)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)、總超氧化物歧化酶試劑盒(T-SOD，南京建成生物工程研究所)、腫瘤壞死因子(TNF-α)試劑盒(上海藍(lán)基)、 印度墨汁(索萊寶公司)、ConA(天根生化科技有限公司)、LPS(索萊寶公司)。車前子多糖配制方法：根據(jù)PSP給藥組計算每只小鼠(平均體重20 g)的給藥量，小鼠的灌胃容積以0.2 ml/10 g為標(biāo)準(zhǔn)，然后以相應(yīng)濃度按每組小鼠的數(shù)量用生理鹽水進(jìn)行配置。以PSP高劑量組(800 mg/kg)為例：每20 g體重小鼠，需要PSP 16 mg，灌胃容積為0.4 ml，則每只小鼠的給藥濃度為16 mg/0.4 ml，以每組10只小鼠計算出灌胃體積和藥物量為4 ml和160 mg，然后用生理鹽水進(jìn)行配置。

1.1.3實驗儀器 Centrifuge 5412R離心機(德國eppendorf公司)、Floustar多功能分儀(美國BMG公司)、倒置生物顯微鏡(日本olympus公司)、-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo Forma公司)、AG135電子天平(Mettler Toled公司)、Millipore純水機(美國Millipore公司)、恒溫水浴(德國Edmund Buhler公司)、CO2培養(yǎng)箱(上海力申儀器公司)、AnkeTDL-80-2C低速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2實驗方法

1.2.1PSP對H22實體瘤小鼠瘤重及脾、胸腺指數(shù)的影響 腫瘤接種:取小鼠腹腔內(nèi)擴增的H22肝癌細(xì)胞，用生理鹽水洗2次,每次1 000 r/min離心5 min。經(jīng)細(xì)胞計數(shù)后，用生理鹽水調(diào)整至濃度為1×107/ml的細(xì)胞懸液，取0.2 ml細(xì)胞懸液接種于小鼠(昆明種，雌雄不限，體質(zhì)量18～22 g)右腋下皮膚，建立實體瘤小鼠模型。實體瘤小鼠模型建立后，進(jìn)行隨機分組，分為5組，每組10只，即陰性對照組(生理鹽水)、陽性對照組(環(huán)磷酰胺30 mg/kg)、PSP劑量組(100、400和800 mg/kg)。灌胃給藥，1次/d，連續(xù)10 d，停藥后次日脫臼處死小鼠。剝離腫瘤并取脾臟、胸腺，去血污稱重，按下式計算抑瘤率和各臟器指數(shù)[5]，比較PSP對腫瘤組織、免疫器官的影響。抑瘤率(%)=(對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%；脾臟指數(shù)=(脾重/體重)×10；胸腺指數(shù)=(胸腺重/體重)×10。

1.2.2PSP對H22實體瘤小鼠血清中MDA、SOD、TNF-α含量的影響 分組及給藥方法同前，停藥后次日小鼠眼眶靜脈取血,所得樣品于3 000 r/min離心10 min，上層清液移取到1.5 ml Eppendroff管中[6]。采用丙二醛測試盒測定小鼠血清中丙二醛(MDA)含量，采用超氧化物歧化酶測試盒測定小鼠血清中總超氧物歧化酶活性(SOD)活力，采用腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測試盒測定小鼠血清中TNF-α含量。

1.2.3PSP對正常及免疫力低下小鼠吞噬指數(shù)的影響 取昆明種小鼠(雌雄不限，體質(zhì)量18～22 g)90只，分兩批。將第一批40只小鼠進(jìn)行隨機分組，分為對照組(生理鹽水)、PSP劑量組(100、400和800 mg/kg)，每組10只。第二批50只小鼠隨機分組，分為對照組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)和PSP劑量組(100、400和800 mg/kg)，每組10只。灌胃，1次/d，連續(xù)7 d。第5日第二批除正常組外，其余各組每只小鼠腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg，連續(xù)3 d，造成免疫力低下小鼠模型。第8天對第一批和第二批每只小鼠尾靜脈注入經(jīng)稀釋的印度墨汁(0.10 ml/10 g)，2 min(t1)和10 min(t2)后分別從眼底靜脈叢取血20 μl，立即吹入盛有2 ml 0.1%Na2CO3溶液試管，吹吸數(shù)次以充分洗出采血血管壁附著的血液，搖勻，15 min后于分光光度計600 nm波長處測定吸光度值OD1(2 min 取血所測吸光度值)和OD2(10 min取血所測吸光度值)，并于第二次采血后，脫臼處死小鼠，稱體重，取肝、脾并稱重[7]。按公式計算碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α:碳粒廓清指數(shù)K=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)，吞噬指數(shù)α=K1/3×體重/(肝重+脾重)。

1.2.4MTT法測定PSP對ConA及LPS 誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響 取雄性BALB/C小鼠2只，脫臼處死，取脾，用培養(yǎng)液制備成濃度為4×1010/ml的脾細(xì)胞懸液。實驗用96孔培養(yǎng)板，各孔加入ConA或LPS溶液各50 μl， PSP給藥組分別加入0.125、0.25、0.5和1 mg/L的藥液 100 μl，陰性對照組加入100 μl完全培養(yǎng)液，所有各孔均加入4×1010/ml的脾細(xì)胞懸液50 μl，混勻。ConA和 LPS的終孔濃度分別為7.5 mg/L和7.8 mg/L。培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。48 h后取出，1 500 r/min離心5 min，吸棄上清液100 μl，每孔分別加入MTT液20 μl后再培養(yǎng)4 h，取出，各孔加入80 μl DMSO，充分混勻，靜置[8]。以200 μl/孔的蒸餾水調(diào)零點,用分光光度儀在波長為570 nm處測定各孔的光密度(OD)值。

2 結(jié)果

2.1PSP對H22實體瘤小鼠瘤重及脾、胸腺指數(shù)的影響 與陰性對照組相比，PSP各組及陽性對照組實體瘤的重量明顯減輕；PSP各組脾及胸腺的指數(shù)顯著增加，而陽性對照組明顯減輕，說明PSP 對脾、胸腺等免疫器官有一定保護作用。見表1。

2.2PSP對H22實體瘤小鼠血清中MDA、SOD、TNF-α含量的影響 與陰性對照組相比，PSP中、高劑量組MDA含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而低劑量組無明顯差異。PSP各組SOD、TNF-α的含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3PSP對正常及免疫力低下小鼠吞噬指數(shù)的影響 PSP對免疫力正常小鼠吞噬指數(shù)無明顯作用，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而與模型組相比，PSP低、中劑量組小鼠吞噬指數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示PSP可顯著增加CTX誘導(dǎo)的免疫力低下小鼠的吞噬指數(shù)。見表3。

表1 PSP對H22實體瘤小鼠瘤重及脾、胸腺指數(shù)的影響

與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4PSP對ConA及LPS誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響 PSP各劑量組促進(jìn)ConA及LPS誘導(dǎo)的T、B淋巴細(xì)胞的增殖作用，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表2 PSP對H22實體瘤小鼠血清中MDA、SOD、TNF-α含量的影響

與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

表3 PSP對免疫力正常及低下小鼠吞噬指數(shù)的影響

與模型組比較*P<0.01

表4 PSP對ConA及LPS誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

腫瘤是目前全世界的主要死亡原因之一，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類生命健康、制約社會經(jīng)濟發(fā)展的一大類疾病。世界衛(wèi)生組織下屬國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)于12日發(fā)布了2018年最新全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)《全球癌癥報告》，報告顯示，2018年全球新增1 810萬例癌癥病例，死亡人數(shù)達(dá)960萬，全球癌癥負(fù)擔(dān)進(jìn)一步加重。腫瘤的治療方法很多，從中草藥中開發(fā)具有抗腫瘤的活性成分已經(jīng)成為當(dāng)前抗腫瘤藥物的研究熱點[9]。中藥多糖的抗腫瘤作用的研究已達(dá)到分子受體水平，且多數(shù)學(xué)者認(rèn)為多糖的抗腫瘤作用機制主要是通過增強肌體的免疫力而達(dá)到的[10]。

免疫系統(tǒng)主要包括淋巴器官、淋巴組織和淋巴細(xì)胞等。脾、胸腺是人體重要的免疫器官，胸腺是T細(xì)胞分化成熟的場所，脾是成熟T、B細(xì)胞定居的場所之一，也是這些細(xì)胞受到抗原等異物刺激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答的部位，對細(xì)胞免疫、體液免疫和巨噬細(xì)胞吞噬功能等發(fā)揮重要的作用[11]，因此在藥理免疫實驗中，經(jīng)常以藥物對動物脾臟、胸腺重量的作用來初步探討其對免疫功能指標(biāo)的作用。本研究結(jié)果表明，PSP可明顯抑制體內(nèi)實體瘤生長，提高脾、胸腺指數(shù)。

免疫細(xì)胞是參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等。T細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的主要組分，具有直接殺傷靶細(xì)胞、輔助或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體及抵御疾病感染、腫瘤形成等多種生物學(xué)功能。B細(xì)胞是主要的抗體分泌細(xì)胞，主要產(chǎn)生體液免疫。B淋巴細(xì)胞可在體液免疫中識別抗原，增殖分化形成記憶細(xì)胞和漿細(xì)胞，其通過細(xì)胞間接觸和分泌細(xì)胞因子，參與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。T、B淋巴細(xì)胞是肌體重要的免疫細(xì)胞，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗是檢測T、B淋巴細(xì)胞增殖活性的一種有效方法，常用來觀察藥物對肌體免疫功能的影響[12]。ConA(刀豆蛋白A)能誘導(dǎo)T細(xì)胞表達(dá)IL22受體，使T細(xì)胞活化。LPS (脂多糖)是B細(xì)胞的多克隆激活劑，能刺激B細(xì)胞發(fā)生有絲分裂。本實驗結(jié)果表明，在沒有其他免疫細(xì)胞參與的情況下，PSP對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞的增值有明顯的作用。說明PSP可直接作用于T、B淋巴細(xì)胞，促進(jìn)T、B細(xì)胞的增殖，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是肌體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量肌體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一。作為非特異性免疫功能之一，吞噬功能是免疫系統(tǒng)排除異物，清除自身衰老及突變細(xì)胞維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要手段。碳粒廓清實驗是免疫學(xué)實驗技術(shù)中非特異性免疫功能測定的常用方法之一。目前，國內(nèi)外學(xué)者廣泛使用小鼠碳粒廓清實驗作為藥物對非特異性免疫功能影響的檢測指標(biāo)。小鼠碳廓清實驗中所測得的廓清指數(shù)K可反映網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，而吞噬指數(shù)α則可反映單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力[13]。本研究結(jié)果顯示，PSP可顯著提高免疫力低下小鼠的吞噬指數(shù)。

MDA是活性氧對生物膜脂質(zhì)分子過氧化作用的產(chǎn)物， MDA 高水平表達(dá)與癌侵襲力增強、惡性程度增高有關(guān)[14]。SOD 是氧自由基的清除劑，其與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[15]。SOD上調(diào)能降低腫瘤細(xì)胞活力，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[16]。腫瘤壞死因子(TNF)是一種主要由巨噬細(xì)胞分泌的多活性蛋白質(zhì)細(xì)胞因子, 參與了癌癥患者的病情發(fā)展和病理生理學(xué)變化[17]。研究表明TNF-α具有殺滅腫瘤組織的作用[18]。通過測定MDA 、SOD 和TNF-α含量可判斷藥物的抗腫瘤作用。本研究結(jié)果顯示，PSP可明顯降低MDA的含量，提高SOD和TNF-α活性，說明PSP抗腫瘤作用與氧自由基有一定的關(guān)系。

本文通過研究PSP的體內(nèi)抗腫瘤作用表明，PSP可通過增強肌體免疫功能，發(fā)揮抑制體內(nèi)腫瘤生長的作用，且其抗腫瘤作用與氧自由基也有一定的關(guān)系。PSP的抗腫瘤機制還需進(jìn)一步研究，為其作為新型輔助抗腫瘤藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。