鰱早期發(fā)育對(duì)過飽和總?cè)芙鈿怏w響應(yīng)與仔魚耐受性的研究

楊傳順，吳湘香，杜開開，柳 凌，茹輝軍，張 燕，倪朝輝，李云峰

(1.上海海洋大學(xué)，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中上游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，武漢 430223)

高壩泄水時(shí)，大量氣體被卷入水體深處使水體中的溶解氣體(主要包括溶解氧(DO)、溶解氮(DN))過飽和，稱為水體總?cè)芙鈿怏w(TDG)過飽和[1]。這些過飽和水體流入下游河道后，沿程并不會(huì)很快釋放出來[2]，使得生活在其中的水生生物長(zhǎng)期處于溶解氣體過飽和的環(huán)境中，導(dǎo)致魚類患?xì)馀莶?，影響魚類生理及繁殖[3]。

國(guó)外關(guān)于TDG過飽和水體對(duì)魚類影響的研究開展較早[4，5]。早在1905年Marsh和Gorham就第一次具體地描述了氣栓在魚類血液循環(huán)系統(tǒng)的形成過程和危害程度[6]。20世紀(jì)60年代，哥倫比亞斯內(nèi)克河(Columbia and Snake River)修建了大量蓄水和發(fā)電的高壩，在汛期高速下泄的河水卷入大量的氣體，導(dǎo)致大壩下游溶解性氣體達(dá)到過飽和狀態(tài)，造成了魚類尤其是大馬哈魚、虹鱒大量死亡[7-9]。Weitkamp等[10]研究發(fā)現(xiàn)在1997—2000年汛期期間，Clark Fork河下游TDG飽和度最高達(dá)到150%，導(dǎo)致當(dāng)?shù)佤~類患上嚴(yán)重的氣泡病。還有研究表明魚類在不同的生長(zhǎng)階段對(duì)氣體過飽和的忍耐性是不同的[11-14]。

在國(guó)內(nèi)，隨著長(zhǎng)江上游河流梯級(jí)開發(fā)，高壩密集建設(shè)，水體溶解氣體過飽和問題越來越嚴(yán)重，TDG過飽和水體嚴(yán)重威脅到了壩下游水生生物尤其是魚類的生存[2]。針對(duì)長(zhǎng)江中上游TDG過飽和對(duì)魚類的影響，國(guó)內(nèi)開展了一系列[15-20]研究。董杰英等[21]發(fā)現(xiàn)四大家魚暴露在溶解氣體過飽和的環(huán)境中容易出現(xiàn)眼球突出、鰭充血和身上出現(xiàn)氣泡等一系列氣泡病癥狀。梁瑞峰等[22]研究發(fā)現(xiàn)孵化率會(huì)隨總?cè)芙鈿怏w飽和度的升高而降低，較高的總?cè)芙鈿怏w飽和度能加快其孵化速率。長(zhǎng)江中上游水電工程開發(fā)所帶來的TDG過飽和問題，不僅使長(zhǎng)江主要經(jīng)濟(jì)魚類及珍稀保護(hù)魚類的生存面臨挑戰(zhàn)，而且也對(duì)魚類的早期資源量產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。本研究以中上游主要經(jīng)濟(jì)魚類——鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)為對(duì)象，通過研究TDG過飽和水體對(duì)鰱早期生活史的影響及耐受性，以豐富TDG過飽和水體對(duì)魚類早期發(fā)育影響的資料，同時(shí)也為高壩下游生態(tài)保護(hù)措施的制定提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料來源

實(shí)驗(yàn)用鰱受精卵取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所窯灣試驗(yàn)場(chǎng)，從產(chǎn)卵池的集卵箱一次采集3 000～5 000粒卵，放入盛有產(chǎn)卵池水的塑料箱中，隨即轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室的養(yǎng)魚池中，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用。

實(shí)驗(yàn)用幼魚同樣取自長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所窯灣試驗(yàn)場(chǎng)，分別在鰱水花下塘后第15、25、35、45和120天的魚種塘拉網(wǎng)獲得。每次取5 000尾左右的幼魚迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室的水泥池(水體約2 m3)中暫養(yǎng)。暫養(yǎng)水是經(jīng)過曝氣的井水，水溫為18.2～21.4 ℃，溶解氧(DO)濃度為7 mg /L。暫養(yǎng)3 d后挑選出規(guī)格一致、體表完整、體質(zhì)健康個(gè)體準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。

1.2 不同濃度TDG水的制備

實(shí)驗(yàn)裝置包括模擬高壩泄水生成TDG過飽和水的試驗(yàn)系統(tǒng)(專利號(hào)ZL 2017 2 0786771.7)如圖1，主要包括水泵、蓄水池、壓力罐、空壓機(jī)、管道等部件。

圖1 過飽和水發(fā)生裝置Fig.1 Schematic of an experimental system

過飽和水的產(chǎn)生：空壓機(jī)向壓力罐中打入一定量的空氣后，打開水泵向壓力罐中泵入一定量的水，泵入的水通過文丘里管使水流分流，增大水體與氣體的接觸面積，使水體快速與空氣混合。進(jìn)水量一定時(shí)，通過調(diào)節(jié)出水口出水量的大小保持壓力罐罐內(nèi)一定的壓強(qiáng)，產(chǎn)生高飽和度的水體，將生成的高濃度過飽和水體與正常水通過控制流量以不同比例混合，可同時(shí)產(chǎn)生不同飽和度的水。實(shí)驗(yàn)過程中，保持魚卵塑料箱或者實(shí)驗(yàn)池的水體積一定，以一定的速率向魚卵塑料箱或者實(shí)驗(yàn)池加入高飽和度的原水且等流量的溢出相同體積的水體，以此維持飽和度相對(duì)穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)用水是井水，溫度基本穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)過程中每隔2 h用TDG儀器進(jìn)行測(cè)量和記錄，并根據(jù)測(cè)量的情況隨時(shí)對(duì)飽和度進(jìn)行及時(shí)調(diào)節(jié)，保證實(shí)驗(yàn)飽和度的相對(duì)穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)過程中TDG飽和度的測(cè)定選用丹麥Oxyguard公司生產(chǎn)的Handy Polaris TGP(Total Dissolved Gas Pressure)測(cè)定儀，其量程為0～200%，其精度為±1%。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 受精卵孵化實(shí)驗(yàn)

將準(zhǔn)備好的鰱受精卵分別放入加有不同TDG飽和度水體的塑料箱中，箱底部有一個(gè)直徑20 mm的進(jìn)水口，箱頂部有兩個(gè)溢水口，每個(gè)塑料箱約含0.25m3的水體，放入約300粒左右的受精卵。試驗(yàn)飽和度分別設(shè)定為110%，120%，130%和140% 4個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組4組平行。對(duì)照組用水采用調(diào)制的井水，飽和度為80%。試驗(yàn)期間的孵化水溫控制在(21±0.5)℃。

試驗(yàn)開始后，按事先設(shè)定好的不同發(fā)育時(shí)期，即原腸晚期、脊索形成期、心跳期和尾芽期，從各試驗(yàn)組中隨機(jī)挑選20粒左右的受精卵置于10倍的體視鏡(型號(hào)SZ61，生產(chǎn)廠家奧林巴斯)下觀察胚胎發(fā)育情況，記錄被觀察卵的數(shù)目和畸形數(shù)。孵化約35 h后，每隔0.5 h，觀察各試驗(yàn)組和對(duì)照組的出膜情況，記錄出膜幼苗數(shù)和出膜時(shí)間。

待出膜完成后，對(duì)各試驗(yàn)組和對(duì)照組換一次水，同時(shí)挑出死卵，繼續(xù)觀察幼苗的胚后發(fā)育情況。每天統(tǒng)計(jì)各組的死亡數(shù)量并記錄相應(yīng)的死亡時(shí)間，直到仔魚平游之前。

1.3.2 不同階段的幼魚暴露實(shí)驗(yàn)

將暫養(yǎng)3 d，經(jīng)過挑選的試驗(yàn)用幼魚，放入架設(shè)在灌有不同濃度TDG水的不銹鋼圈支撐的圓柱形網(wǎng)箱(直徑100 cm、高50 cm)中。15、25、35、45 d發(fā)育的鰱幼魚每個(gè)圓柱形網(wǎng)內(nèi)放入200尾左右，120 d發(fā)育的鰱幼魚每個(gè)圓柱形網(wǎng)內(nèi)放入50尾左右。每個(gè)飽和度組設(shè)4個(gè)平行組，水溫(21±0.5)℃。連續(xù)觀察96 h，記錄各試驗(yàn)組中魚的活動(dòng)及死亡情況，若出現(xiàn)死亡，記錄死亡時(shí)間和死亡數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)整理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS21軟件進(jìn)行方差分析，并采用Duncan多重比較進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 過飽和水體對(duì)鰱受精卵孵化的影響

不同TDG飽和度下對(duì)鰱受精卵孵化的影響結(jié)果見表1。從表1中可以看出，各試驗(yàn)組在發(fā)育過程中均有一定程度的畸形率，與對(duì)照組比較差異不顯著。出膜率最高是過飽和110%試驗(yàn)組，其平均出膜率達(dá)到了92.3%，與對(duì)照組比較存在顯著差異。

表1 不同TDG飽和度下鰱受精卵孵化的影響Tab.1 Effect of various TDG supersaturation levels on silver carp fertilized eggs incubationin different experimental groups

受精卵孵化的出膜時(shí)間和數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖2。圖2顯示，(21±0.5)℃溫度下，試驗(yàn)組受精卵出膜峰值時(shí)間較對(duì)照組出現(xiàn)不同程度的提前，但過飽和110%試驗(yàn)組出膜時(shí)間最早，出現(xiàn)在38.5 h左右，而同一溫度下，對(duì)照組出現(xiàn)在41.5 h左右，隨著試驗(yàn)過飽和濃度升高，受精卵出膜的峰值時(shí)間逐漸接近對(duì)照組。

圖2 不同TDG飽和度下鰱受精卵出膜率與時(shí)間的關(guān)系Fig.2 Relationship between hatching rate and exposure time

對(duì)出膜后的幼體進(jìn)行胚后發(fā)育觀察的結(jié)果見表2。從表2可看出，在(21±0.5)℃溫度下，無論試驗(yàn)組還是對(duì)照組都經(jīng)歷了5 d左右的胚后發(fā)育，發(fā)育時(shí)間和發(fā)育速度均無明顯差異。

從表2可看出，試驗(yàn)組存活率均比對(duì)照組低，存在顯著性差異，130%試驗(yàn)組與140%試驗(yàn)組沒有顯著性差異。試驗(yàn)組120%、130%和140%的最后存活率高于試驗(yàn)組110%，且隨著飽和度的增加，存活率會(huì)稍微升高。各試驗(yàn)組幼苗的死亡主要集中在出膜后第2～3天。110%試驗(yàn)組在出膜第2天的平均死亡率為13.6%，第3天的平均死亡率為13.7%，均明顯高于其他組。

表2 不同TDG飽和度對(duì)鰱幼苗的影響Tab.2 Effect of various TDG supersaturation levels on silver carp fries in different experimental groups

注：n=4,凡有相同字母的表示差異性不顯著，反之則表示差異顯著。

上述研究結(jié)果表明水體的過飽和對(duì)鰱受精卵的發(fā)育速度和畸形率沒有明顯的影響，但110%試驗(yàn)組顯著提高了受精卵的出膜率，同時(shí)提早了受精卵的出膜時(shí)間。其它試驗(yàn)組雖然在出膜時(shí)間和出膜率上與對(duì)照組比較有一定的差異，但無顯著性差異，因此表明高飽和度的水體對(duì)受精卵的出膜率和出膜時(shí)間均無影響。對(duì)胚后發(fā)育的觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較各種飽和度的水體均能導(dǎo)致胚后發(fā)育幼苗的存活率降低，幼苗死亡的時(shí)間主要集中在出膜后第2天和第3天。

2.2 不同生長(zhǎng)階段的鰱幼魚對(duì)過飽和氣體的耐受性研究

不同生長(zhǎng)階段的鰱幼魚對(duì)不同TDG飽和度耐受性的結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，不同生長(zhǎng)階段的鰱幼魚對(duì)不同飽和度水體的耐受性存在差異。圖3(a)和(b)顯示了15和25 d的鰱幼魚在不同飽和度水體中的耐受性。結(jié)果表明15和25 d鰱幼魚在各試驗(yàn)飽和度水體中死亡率很低，與對(duì)照組幾乎無差異。96 h后15和25 d的鰱幼魚總死亡率分別為2.5%和5.0%。因此，不同飽和度水體對(duì)15和25 d的鰱幼魚存活率幾乎無影響。圖3(c)顯示了35 d鰱幼魚在不同飽和度水體中的耐受性。結(jié)果表明110%試驗(yàn)組中鰱幼苗的總死亡率與對(duì)照組比較無顯著性差異。但120%，130%和140%試驗(yàn)組中鰱幼苗均出現(xiàn)了較高的死亡率，且TDG飽和度越高，死亡率也越高，96 h后3個(gè)試驗(yàn)組的總死亡率分別為19.1%、21.0%和25.0%。由此可見，對(duì)于生長(zhǎng)35 d的幼苗TDG飽和度越高，死亡率也越高，最高可達(dá)到25.0%。圖3(d)和(e)顯示了45 d和120 d鰱幼魚在不同飽和度水體中的耐受性。從圖中可以看出，隨著鰱幼苗在TDG過飽和水體中暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，其死亡率也會(huì)相應(yīng)增加，并且隨著TDG飽和度的增加，死亡率相應(yīng)增加。96 h后兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組總死亡率為60%～100%。

綜上所述，鰱幼苗在生長(zhǎng)25 d前，對(duì)TDG不敏感，幾乎不受TDG飽和度影響。生長(zhǎng)到35 d時(shí)，低飽和度的TDG對(duì)幼苗仍然沒有影響，但120%以上的高飽和度TDG對(duì)幼苗會(huì)產(chǎn)生一定程度的影響，導(dǎo)致幼苗死亡率隨TDG飽和度升高而增加。45 d后到120 d的鰱幼苗，對(duì)TDG過飽和水體非常敏感，各飽和度的TDG均能導(dǎo)致鰱幼苗迅速死亡，但各飽和度的TDG對(duì)鰱幼苗死亡率的影響有一定差異。幼苗死亡均發(fā)生在暴露7 h左右，暴露96 h后，45 d的死亡率在60%～81%，120 d的死亡率為86%～100%。

圖3 不同階段鰱暴露時(shí)間和死亡率關(guān)系(a-e分別表示：15、25、35、45、120 d)Fig.3 Relationship between exposure time and mortality in different stages of silver carp

3 討論

3.1 TDG對(duì)鰱受精卵孵化的影響分析

有學(xué)者研究認(rèn)為TDG在一定飽和度下對(duì)有些魚類的受精卵發(fā)育是有影響的，Meekin等[12]發(fā)現(xiàn)當(dāng)氣體飽和度達(dá)到112%時(shí)，在同一個(gè)孵化場(chǎng)內(nèi)虹鱒魚卵發(fā)生了嚴(yán)重的死亡，但大鱗大馬哈魚魚卵卻沒有受到影響。郝思平等[23]也發(fā)現(xiàn)，溶氧量越高，在某些情況下，孵化期內(nèi)胚胎死亡率下降[24]。但Marsh等[11]和許多學(xué)者均報(bào)道了過飽和水體對(duì)魚卵的孵化不會(huì)產(chǎn)生影響且不會(huì)導(dǎo)致氣泡病的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，溫度穩(wěn)定的情況下，水體TDG過飽和對(duì)鰱受精卵的發(fā)育速度和畸形率沒有顯著影響，且沒有發(fā)現(xiàn)受精卵得氣泡病。魚的胚胎發(fā)育是一個(gè)耗氧過程，有充足的氧可以保證胚胎的正常發(fā)育，有利于孵化率的提高。本研究的結(jié)果與Marsh等[11]的研究結(jié)果基本一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TDG飽和度在110%時(shí)，對(duì)受精卵的出膜率和出膜時(shí)間均有顯著性的影響，它有效提高了受精卵的出膜率和出膜時(shí)間。Oppenberntsen等[25]試驗(yàn)表明低氧環(huán)境下，大西洋鮭胚胎的孵化時(shí)間比高氧環(huán)境情況下短。Rombough[26]研究也認(rèn)為當(dāng)受精卵內(nèi)氧氣供應(yīng)不足時(shí)，仔魚迫于氧氣的需求提前孵化而保證生存，但畸形率會(huì)提高，導(dǎo)致孵化率下降。因此，推測(cè)110%試驗(yàn)組的提前出膜與受精卵內(nèi)低氧環(huán)境有關(guān)。由于過飽和氣體極易在受精卵膜表面吸附一層空氣泡，部分阻斷了卵內(nèi)外的水體交換，使卵內(nèi)的氧氣含量降低，造成受精卵處在一個(gè)低氧環(huán)境，從而使受精卵提早出膜。但是提早出膜的鰱幼體缺乏保護(hù)，極易受到損傷，因而各種TDG飽和度中的幼體存活率與對(duì)照組比較均降低了，且出膜越早存活率越低。這個(gè)結(jié)果與Rombough[26]的研究結(jié)果是一致的。

3.2 不同生長(zhǎng)階段的鰱幼魚對(duì)過飽和氣體的耐受性分析

已有研究表明魚類在不同的生活階段對(duì)于氣體過飽和的忍耐性是不同的[11-14]，Meekin等[12]報(bào)道隨著大鱗大馬哈魚年齡的增長(zhǎng)，對(duì)于溶解性氣體的忍耐性卻逐漸降低，死亡時(shí)間也逐漸縮短。Rucker[13]用不同體長(zhǎng)的銀大馬哈魚進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示體長(zhǎng)小(40 mm)的魚比體長(zhǎng)大(53 mm、67 mm)的魚對(duì)于氣體過飽和水體具有更強(qiáng)的耐受性。Counihan等[14]進(jìn)行了高首鱘在個(gè)體發(fā)育過程的不同階段氣泡病發(fā)生的研究，結(jié)果表明孵化后6 d內(nèi)，發(fā)育時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)氣體飽和度的耐受性越弱。梁瑞峰等[22]研究了過飽和TDG對(duì)重口裂腹魚生長(zhǎng)、繁殖的影響，結(jié)果表明孵化后相同發(fā)育日齡的重口裂腹魚對(duì)過飽和水體的耐受性隨著飽和度的增加而降低。Smiley等[27]發(fā)現(xiàn)，暴露在122%飽和水體中，成齡鱸在23 ℃和18 ℃水體中的死亡率比幼齡鱸魚高20%。

本研究中鰱幼苗在生長(zhǎng)25 d前，對(duì)TDG不敏感，幾乎不受任何飽和度TDG影響。生長(zhǎng)到35 d時(shí)，低飽和度的TDG對(duì)幼苗仍然沒有影響，但120%以上的高飽和度的TDG對(duì)幼苗產(chǎn)生了一定程度的影響，導(dǎo)致幼苗死亡率隨TDG飽和度升高而增加，跟梁瑞峰等[22]研究的結(jié)果基本相似。45 d后到120 d的鰱幼苗，對(duì)各種飽和度的TDG都非常敏感，各種飽和度的TDG均能導(dǎo)致鰱幼苗迅速死亡，且飽和度越高死亡率也越高。這些研究結(jié)果與梁瑞峰等[22]、Smiley等[27]的研究結(jié)果基本一致。

分析認(rèn)為早期幼苗在各種飽和度水體中的死亡率都比較低，隨著個(gè)體發(fā)育各個(gè)飽和度的死亡率開始升高，這可能由于魚類發(fā)育過程中呼吸方式的改變所致。魚類的呼吸方式主要包括水呼吸和氣呼吸，是魚類對(duì)生活環(huán)境和生活方式的適應(yīng)。魚類的呼吸器官有主要呼吸器官和輔助呼吸器官之分，前者是鰓，絕大部分魚類通過鰓進(jìn)行水呼吸，但一些魚類為了適應(yīng)特殊的生活條件還通過皮膚、鰓上器官、腸管、口腔黏膜、鰾、氣囊等輔助呼吸器官進(jìn)行氣呼吸[28，29]。魚類的呼吸器官在仔魚孵化后一段時(shí)間才發(fā)育完善，在此之前，氣體交換通過體表皮膚、鰭?cǎi)藓吐腰S囊上豐富的血管直接與水接觸來進(jìn)行[29]。早期階段魚類氣體通過體表皮膚、鰭?cǎi)藿粨Q，這些組織可能對(duì)TDG不敏感，因此降低了TDG對(duì)其本身的傷害。隨著發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)，呼吸方式開始改變，其對(duì)TDG的敏感度不斷上升。Hughes[30]發(fā)現(xiàn)，活躍魚類的鰓絲數(shù)、鰓絲長(zhǎng)、鰓小片密度大于中等活動(dòng)性魚類和活動(dòng)遲鈍魚類，但活躍性魚類的單個(gè)鰓小片面積小于緩慢性魚類，這可能是因?yàn)榛钴S性魚類代謝速率和能量需求較高，需要較大的交換面積，但較小的鰓小片對(duì)水的阻力較小，符合其對(duì)快速活動(dòng)的要求。同種但不同規(guī)格魚類的呼吸面積也有所不同，一般鰓絲數(shù)量、長(zhǎng)度、單個(gè)鰓小片面積、總呼吸面積隨體質(zhì)量的增加而增大，鰓小片密度、相對(duì)呼吸面積隨體質(zhì)量的增加而減小，其中單側(cè)鰓絲數(shù)、總鰓絲數(shù)與體質(zhì)量呈對(duì)數(shù)關(guān)系，鰓小片數(shù)、單個(gè)鰓小片面積、總呼吸面積及相對(duì)呼吸面積與體質(zhì)量呈冪指數(shù)關(guān)系[31，32]。從生活環(huán)境看，鰱喜居于水的中上層，是屬于活躍魚類。隨著其發(fā)育的時(shí)間的增長(zhǎng)，呼吸器官不斷完善，呼吸方式慢慢轉(zhuǎn)變。當(dāng)其基本發(fā)育完全時(shí)，由于其鰓的構(gòu)造等導(dǎo)致其氣體交換比較快，對(duì)于高壓下的高溶解氣體環(huán)境產(chǎn)生強(qiáng)烈不適應(yīng)，因而表現(xiàn)出對(duì)氣體過飽和水體較為敏感，導(dǎo)致其隨著發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)，在過飽和水體中的死亡率升高。