山楝中殺蟲活性化學(xué)成分的提取與研究

樊世瑞，蔡潔云，楊碧娟，王宜挺，陳鐸之，郝小江

(1.云南大學(xué) 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650091；2.中國科學(xué)院 昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；3.云南煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，云南 昆明 650091)

山楝屬是楝科植物的重要組成，其化學(xué)成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變，活性獨(dú)特，是植物化學(xué)研究的一個(gè)關(guān)注焦點(diǎn).山楝的拉丁名為Aphanamixispolystachya(Wall.) R. N. Parker，在孟加拉被稱為“tiktaraj”[1].主要分布于印度、中南半島、馬來西亞.我國產(chǎn)4種，分布于廣東、廣西和云南及臺(tái)灣等省區(qū)[2].山楝之所以備受關(guān)注，是源于其種子、樹皮、葉子、果實(shí)等作為植物藥在民間的廣泛使用[3].山楝的樹皮具有收斂止血的功效，常用于脾臟及肝臟方面的疾病、癌癥及腹部的各種不適；其種油可制成針對風(fēng)濕病的搽劑(liniment)[4].其種子辛辣味苦，有瀉下及驅(qū)蠕蟲的功效，并可治愈胃潰瘍[5- 6].此外，山楝的果實(shí)在去除苦味的油脂后，通常為用作肥料[7].山楝同時(shí)還是一類重要的農(nóng)藥來源植物，其中檸檬苦素類化合物如川楝素、印楝素等是重要的驅(qū)蟲農(nóng)藥.文中對瀾滄產(chǎn)山楝枝葉的次生代謝產(chǎn)物及其生物活性進(jìn)行系統(tǒng)性研究并從山楝中得到5個(gè)具有良好殺蟲活性的化合物，報(bào)告倍半萜化合物4個(gè)、甾體類化合物1個(gè).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料、試劑及儀器

Bruker AM-400、Bruker DRX-500或Avance Ⅲ600 超導(dǎo)核磁共振儀.Finnigan MAT 90 和VG Auto Spec-3000 質(zhì)譜儀.UV用Shimadzu-210A double-beam spectrophotometer測定.IR用KBr片通過Bruker-Tensor-27 spectrometer測定.熔點(diǎn)由X-4顯微熔點(diǎn)儀測定.柱層析(Column chromatography，CC)用硅膠(60～80 目，200～300目，300～400目，青島海洋化工廠生產(chǎn))、MCI gel(CHP20P, 75～150 μm, Mitsubishi Chemical Industries Ltd, Tokyo, Japan)、C8反相硅膠(20～45 μm, Merck, Darmstadt, Germany)、C18反相硅膠(40-63 μm, Merck, Darmstadt, Germany)或Sephadex LH-20 gel (40～70 μm, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden).TLC用預(yù)制硅膠板 GF254 (青島海洋化工廠生產(chǎn)) 和預(yù)制硅膠板60 F254 (Merck, Darmstadt, Germany) .半制備HPLC用Hypersil Gold RP-C18柱(i.d. 10 mm × 250 mm; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA)，條件為室溫下用CH3CN-H2O洗脫.

山楝A.polystachya(Wall.) R. N. Parker 的枝葉于2015年8月采自云南省瀾滄地區(qū)，樣品由中國科學(xué)院昆明植物研究所的陳瑜研究員鑒定.

1.2 山楝中化學(xué)成分的提取方法

取自然風(fēng)干的山楝枝葉30 kg，粉碎后，用90%乙醇提取，濃縮得浸膏，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取.乙酸乙酯萃取部分依次用V(石油醚)∶V(丙酮)=50∶1～1∶1、V(氯仿)∶V(甲醇)=10∶1～ 0∶1梯度洗脫，得到7個(gè)組分(Fr.1～7).

其中，F(xiàn)r.5經(jīng)MCI柱層析、C8反相硅膠柱層析、反復(fù)Sephadex LH-20柱層析、硅膠柱層析、HPLC半制備C18反相柱柱層析，得到化合物1(270 mg)、2(120 mg)、3(50 mg)、4(28 mg)、5(80 mg),提取路線如圖1所示.

1.3 提取化合物波譜數(shù)據(jù)

化合物115-羥基-α-杜松醇, 白色無定型粉末. ESI-MS (m/z): 261 [M+H]+，分子式為C15H26O2；1H NMR和13C NMR (MeOD,600 MHz) 具體數(shù)據(jù)見表1.

表1 化合物1核磁數(shù)據(jù)

化合物21S,4S,5S,10R-4,10-愈創(chuàng)木烷二醇,白色無定型粉末. ESI-MS (m/z): 239 [M+H]+，分子式為C15H28O2.13C NMR (CDCl3, 100 MHz) 149.6，(s, C-7), 121.2 (d, C-6), 80.2 (s, C-4), 75.3 (s, C-10)，50.6 (d, C-1), 50.2 (d, C-5), 42.5 (t, C-9), 40.4 (t, C-3), 37.3 (d, C-11), 22.5 (q, C-15), 21.5 (t, C-2)，21.5 (t, C-8), 21.4 (q, C-12), 21.3 (q, C-13), 21.1 (q, C-14).

化合物34(15)-桉葉烯-1β,6β-二醇，白色無定型粉末. ESI-MS (m/z)： 847 [2M + Na]+.1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 0.70 (3H, s, H-14), 0.86 (3H, d,J= 7.0, H-12), 0.94 (3H,s,J= 7.0, H-13), 3.41 (dd,J= 4.7, 11.5, H-1), 3.70 (t,J= 9.8, H-6), 4.73 (s, H-5β), 5.01 (s, H-5α).13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 11.6 (C-14), 16.1 (C-13), 18.0 (C-8), 21.1 (C-12), 25.9 (C-11), 31.8 (C-2), 35.0 (C-3), 36.2 (C-9), 41.6 (C-10), 49.2 (C-7), 55.8 (C-5), 66.9 (C-6), 78.9 (C-1), 107.8 (C-15), 146.2 (C-4).

化合物44(15)-桉葉烯-1β,6α-二醇，白色無定型粉末.ESI-MS(m/z)：239[M+H]+, 分子式為C15H26O2.1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.04 (3H, s, H-30), 1.20 (3H, d,J= 7.0, H-12), 1.29 (3H, d,J= 7.0, H-13), 3.71 (dd,J= 4.1, 11.2, H-1), 4.03 (t,J= 9.7, H-6), 5.08 (s, H-5β), 5.33 (s, H-5α).13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 12.7 (C-14), 17.0 (C-13), 19.4 (C-8), 22.3 (C-12), 27.1 (C-11), 32.9 (C-2), 36.5 (C-3), 37.5 (C-9), 43.1 (C-10), 51.2 (C-7), 56.7 (C-5), 68.3 (C-6), 79.9 (C-1), 109.1 (C-15), 147.0 (C-4).

化合物53α,16β,20,22-四羥基麥角甾-5,24(28)-二烯，白色無定型粉末.ESI-MS (m/z)：469 [M + Na]+，分子式為C28H46O4.1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 1.09 (3H, d,J= 2.2, H-27), 1.11 (3H, s, H-19), 1.12 (3H, d,J= 2.2, H-26), 1.52 (3H, s, H-21), 1.58 (3H, s, H-18), 3.89 (br.s, H-22), 4.62 (1H, d,J= 9.7, H-16), 4.94 (s, H-28), 4.90 (br.s, H-28), 5.44 (d,J= 5.7, H-6) .13C NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 15.7 (C-18), 20.1 (C-19), 21.2 (C-11), 21.6 (C-21), 22.7 (C-27), 22.0 (C-26), 31.8 (C-8), 31.2 (C-7), 31.4 (C-2), 34.1 (C-25), 37.4 (C-10), 38.3 (C-1), 38.6 (C-23), 39.0 (C-15), 41.1 (C-12), 44.0 (C-4), 44.2 (C-13), 51.0 (C-9), 55.4 (C-14), 58.1 (C-17), 71.7 (C-3), 73.5 (C-16), 75.5 (C-22), 80.2 (C-20), 108.8 (C-28), 121.6 (C-6), 142.6 (C-5), 155.3 (C-24).

1.4 殺蟲活性檢測

鹵蟲 [brine shrimp (Artemiasalina)] 殺蟲活性模型，樣品溶于DMSO或水中取適量加于96孔板上.每空加28 ℃人工海水孵化48 h的鹵蟲15～25頭，并以人工海水分別將樣品稀釋至100、50、10(μmol/L)、每個(gè)濃度重復(fù)3次.空白對照為溶解樣品所用溶劑.28 ℃下培養(yǎng)24 h后顯微鏡下觀察鹵蟲死亡個(gè)數(shù).

活性用校正死亡率表示：

校正死亡率 (corrected mortality)=(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)× 100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)解析

化合物1白色粉末，質(zhì)譜顯示其分子式為C15H26O2；不飽和度為3，碳譜顯示化學(xué)位移48.3(d)與71.5(d)為2個(gè)環(huán)內(nèi)CH，而139.0(s)與125.1(s)信號(hào)提示該化合物具有環(huán)內(nèi)雙鍵結(jié)構(gòu)，同時(shí)15.8(q)、22.0(q)、28.8(q)3處信號(hào)表明該化合物具有3個(gè)環(huán)外甲基，結(jié)合該化合物不飽和度為3，具備杜松烷型倍半萜結(jié)構(gòu)特征，經(jīng)過進(jìn)一步分析核磁數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)該化合物還具備2個(gè)羥基(其中1個(gè)為羥甲基)，1個(gè)丙叉基通過查閱文獻(xiàn)，其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]對照一致，因此確定其結(jié)構(gòu)為15-羥基-α-杜松醇.

化合物2白色粉末，質(zhì)譜顯示其分子式為C15H26O2；不飽和度為3，通過碳譜數(shù)據(jù)可以看出與化合物1類似該化合物具有2個(gè)角甲基，1個(gè)丙叉基，2個(gè)羥基，1個(gè)雙鍵，但是不同的是，該化合物丙叉基與環(huán)內(nèi)雙鍵中的1個(gè)碳原子相連，提示該類化合物很可能是1個(gè)愈創(chuàng)木烷型雙環(huán)倍半萜.通過與已知文獻(xiàn)[9]對照，確定該化合物為1S,4S,5S,10R-4,10-愈創(chuàng)木烷二醇.

化合物3分子式 C15H26O2，由 ESI-MS 上的m/z847 [2M + Na]+確定.不飽和度為3，碳譜信號(hào)107.8 (s), 146.2 (t)表明該化合物結(jié)構(gòu)中存在1個(gè)末端烯鍵結(jié)構(gòu)，結(jié)合不飽和度為3，以及分子中具有丙叉基結(jié)構(gòu)，考慮該化合物為雙環(huán)體系桉烷型雙環(huán)倍半萜.波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10-11]對照一致，因此確定其結(jié)構(gòu)為4(15)-桉葉烯-1β,6β-二醇.

化合物4分子式C15H26O2，由ESI-MS確定.該化合物核磁數(shù)據(jù)與化合物3相似程度較高，僅1個(gè)位置羥基取代基構(gòu)型不同，碳譜顯示該化合物同樣具有1個(gè)角甲基，1個(gè)環(huán)外末端雙鍵，1個(gè)丙叉基，2個(gè)羥基，1個(gè)雙鍵.波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11-12]對照一致，因此確定其結(jié)構(gòu)為4(15)-桉葉烯-1β,6α-二醇.

化合物5分子式C28H46O4，由ESI-MS 上的m/z469 [M + Na]+確定，不飽和度為6，從碳譜信號(hào)121.6 (C-6), 142.6 (C-5), 108.8 (C-28), 155.3 (C-24)得出化合物具有2個(gè)雙鍵，其中1個(gè)為環(huán)內(nèi)雙鍵另1個(gè)為末端雙鍵，此外，該化合物具有3個(gè)角甲基，基于以上信息，考慮該化合物為1個(gè)甾體.核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]對照一致，因此確定其結(jié)構(gòu)為3α,16β,20,22-四羥基麥角甾-5,24(28)-二烯.

2.2 化合物殺蟲活性

上述化合物均進(jìn)行了殺蟲(A.salina)活性測試(表2).結(jié)果表明，化合物2、3、4表現(xiàn)出良好的殺蟲活性，提示這類倍半萜在殺蟲領(lǐng)域也許具有一定的應(yīng)用前景.而甾體化合物1和5并未表現(xiàn)出顯著的殺蟲活性.

表2 化合物不同濃度下校正死亡率 %

3 結(jié)語

通過對山楝進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，成功分離得到4個(gè)倍半萜類化合物以及1個(gè)甾體化合物，其結(jié)構(gòu)通過核磁共振、質(zhì)譜等檢測手段予以確認(rèn),其中化合物1和2為本屬首次分離得到.對分離得到的化合物進(jìn)行了殺蟲活性測試，結(jié)果表明，倍半萜類化合物2、3以及4表現(xiàn)出良好的殺蟲活性，提示這類倍半萜在殺蟲領(lǐng)域也許具有一定的應(yīng)用前景.