江西省致病性鉤端螺旋體血清學和分子流行病學研究

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鉤端螺旋體病(簡稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)引起的人獸共患傳染病，主要通過直接或間接接觸感染動物的尿液而感染，主要宿主動物包括嚙齒類動物(黑線姬鼠、黃毛鼠、黃胸鼠和褐家鼠等)，以及家畜(豬、犬和牛等)。近年來以多位點序列分析(Multilocus sequence typing， MLST)為基礎的分型方法，逐漸應用于細菌學基因分型、分子流行病研究。此外，細菌的16S rRNA具有高度的保守性已被廣泛用于鉤體菌基因種鑒定、分子進化的分析指標。江西省作為鉤體病的老疫區(qū)，每年的鉤體病發(fā)病率遠高于全國平均發(fā)病率，而江西省的鉤體病分子流行病學特征尚未見詳細報道。本研究選取江西省2013年以來從宿主動物監(jiān)測中分離到的27株鉤體分離株，利用暗視野顯微鏡凝集試驗進行血清群鑒定，利用16S rRNA基因測序技術(shù)對其進行基因種鑒定，以及利用MLST方法對其進行基因分型研究，初步探討江西省致病性鉤體的血清學、分子流行病學特征，為江西省鉤體病預防控制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 本研究共選用江西省2013年以來嚙齒類動物監(jiān)測中分離到的27株鉤體分離株，分別來自上饒、上高、浮梁和上猶4個地區(qū)。

1.2主要試劑 15群15型鉤體參考菌株診斷血清由中國食品藥品檢定研究院提供；PCR Premix采用大連寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；100 bp DNA Marker采用北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；基因組提取采用北京賽百盛基因技術(shù)有限公司硅膠膜型TM基因組DNA提純試劑盒。

1.3血清群鑒定 采用暗視野顯微鏡凝集試驗(Microscopic agglutination test，MAT)，利用中國15群15型鉤體參考菌株的免疫兔血清，對分離菌株進行血清凝集試驗，利用暗視野顯微鏡觀察，以出現(xiàn)50%菌體凝集菌群為最終鑒定血清群。

1.4菌體DNA制備 鉤體液態(tài)培養(yǎng)基在28 ℃培養(yǎng)7～10 d，達到對數(shù)生長期提取基因組DNA，操作方法按試劑盒說明書進行。

1.516S rRNA基因PCR擴增、測序 參照參考文獻[1]報道的引物序列進行PCR擴增、雙向測序，引物序列如下：fDl：5′-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，rP2：5′-CCC-GGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。采用50 μL PCR反應體系擴增，Premix ExTaq25.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，cDNA模板5 μL，純水補充至50 μL反應體積。PCR擴增參數(shù)如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)，最后72 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物純化、雙向測序由寶生物工程(大連)有限公司完成。

1.6MLST七個位點PCR擴增、測序 參考文獻報道MLST方案[2]，利用7個位點pntA、sucA、pfkB、tpiA、mreA、gluM、caiB進行PCR擴增，各位點信息見表1，引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司完成。采用20 μL反應體系進行擴增，Premix ExTaq10.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板1 μL，純水補充至20 μL反應體積。PCR 擴增程序如下：95 ℃ 預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)，最后72 ℃延伸 10 min。擴增產(chǎn)物純化、雙向測序，由寶生物工程(大連)有限公司完成。

1.7 數(shù)據(jù)分析

1.7.1基因種鑒定 將測序獲得的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，以確定其基因種。

1.7.2MLST研究 將7個位點序列與MLST網(wǎng)站http://pubmlst.org/上相應等位基因進行比較，獲得每株菌等位基因譜(gluM-pntA-sucA-tpiA-pfkB-mreA-caiB)以及STs (Sequence Types)型別。利用BioNumerics軟件進行聚類分析，觀察菌株間的基因多態(tài)性及種群結(jié)構(gòu)。

表1 MLST研究中7個位點信息Tab.1 Seven loci in MLST analysis

2 結(jié) 果

2.1血清群鑒定 經(jīng)MAT試驗結(jié)果顯示：27株江西省致病性鉤體分離株隸屬于4個血清群，分別是黃疸出血群、爪哇群、澳洲群和巴達維亞群。其中黃疸出血群為江西省主要優(yōu)勢血清群，占59.26%(16/27)，其次依次為爪哇群占25.92%(7/27)、巴達維亞群占7.41%(2/27)和澳洲群占7.41%(2/27)。血清群分布存在一定程度的地域差異，浮梁和上饒地區(qū)以黃疸出血群為主，上猶地區(qū)以爪哇群為主，上高地區(qū)僅分離到一株菌株，為澳洲群，詳見圖1。

圖1 27株江西省鉤端螺旋體菌株不同地區(qū)血清群分布Fig.1 Distribution of Serogroups among different regions for 27 Leptospira strains isolated from Jiangxi Province

2.2基因種鑒定 27株分離株的16S rRNA基因測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的鉤體16S rRNA基因序列比對，同源性>99.7%認為是同一個基因種，結(jié)果顯示：27株菌株隸屬于L.interrogans和L.borgpetersenii2個致病性基因種，其中L.interrogans為江西省主要優(yōu)勢基因種，占77.78%(21/27)。基因種分布存在一定的地域差異，例如L.borgpetersenii基因種僅存在于江西省上猶監(jiān)測點，而L.interrogans基因種廣泛存在于上饒、上高、浮梁和上猶4個監(jiān)測點，詳見圖2。

圖2 27株江西省鉤端螺旋體菌株不同地區(qū)基因種分布Fig.2 Distribution of species among different regions for 27 Leptospira strains isolated from Jiangxi Province

2.3MLST基因多態(tài)性分析 MLST研究結(jié)果顯示，27株致病性鉤體呈現(xiàn)5個ST型別，其中ST1為主要優(yōu)勢ST型別，占59.26%(16/27)，其次依次為ST143占22.22%(6/27)、ST105占7.41%(2/27)、ST224占7.41%(2/27)和ST216占3.70%(1/27)。ST分布也存在一定程度的地域差異，ST1分布在浮梁和上饒地區(qū)，ST143僅分布在上猶地區(qū)，ST105分布在上饒和上高地區(qū)，ST216和ST224僅在上猶地區(qū)分布，詳見圖3。

圖3 27株江西省鉤端螺旋體菌株ST型別在不同地區(qū)分布Fig.3 Distribution of sequence types (STs) among different regions for 27 Leptospira strains isolated from Jiangxi Province

2.4BioNumerics軟件分析 UPGMA聚類分析顯示：27株菌株共分為5個Cluster群，分別對應5種ST型，詳見圖4。Cluster1對應ST224，來自2015年上猶菌株；Cluster2對應ST216，為2014年上猶菌株；Cluster3對應ST105，來自2013年上饒和2015上高菌株；Cluster4對應ST1，為江西省的優(yōu)勢克隆群，包括16株2013、2014年上饒和2013-2015年浮梁菌株；Cluster5對應ST143，來自2013-2015年上猶菌株。由聚類圖顯示：ST和血清群構(gòu)成在不同地域上均存在一定程度差異，而不同年代間差異不明顯，ST型別在宿主特異性方面也不明顯。黑線姬鼠作為主要宿主，包括ST224、ST216、ST1和ST143四個ST型。

L.int: L.interrogans, L.bor: L.borgpetersenii.圖4 27株江西省鉤端螺旋體UPGMA聚類分析Fig.4 UPGMA dendrogram of 27 Leptospira strains isolated from Jiangxi Province

3 討 論

江西省是鉤體病的老疫源地，該省每年均有數(shù)例鉤體病上報病例，本研究黃疸出血群為江西省主要流行血清群，其次為爪哇群，L.interrogans為主要致病性基因種，ST1為主要優(yōu)勢ST型別，其次為ST143。徐建民[3]等2010年對2002-2008年的江西監(jiān)測菌株進行PFGE研究發(fā)現(xiàn)：黃疸出血群賴型是江西省人群及動物中優(yōu)勢血清型，本次研究中2013年以來江西主要流行型別在不同年代間變化不大。李世軍等[4-5]對2007-2009年分離自貴州的菌株進行研究發(fā)現(xiàn)：3株分離株均隸屬于L.interrogans基因種，黃疸出血群和ST1型別。王亞琳等[6]報道2010年四川樂至縣人群鉤體疫情主要致病群血清群為黃疸出血群。綜上所述，江西的主要流行株與中國四川、貴州等其他地區(qū)的主要流行菌群、型別一致。

本研究發(fā)現(xiàn)江西地區(qū)鉤體的基因種、血清群及ST型別分布存在地域差異。有文獻報道L.interrogans基因種更適合在潮濕的環(huán)境生存，而L.borgpetersenii基因種在潮濕和干燥的環(huán)境均能生存[7]。有實驗數(shù)據(jù)表明：L.interrogans適合在外環(huán)境例如外界表面水體中生存，可通過接觸疫水傳播鉤體病，而L.borgpetersenii基因種不容易在外界環(huán)境生存，主要通過宿主動物間的直接傳播[8]。上猶處于江西的贛南山地地區(qū)，海拔在1 000～1 600 m左右；而上饒、上高和浮梁處于贛北丘陵地區(qū)，海拔在100～300 m左右，可能不同的海拔高度、地理位置、氣候、宿主動物、環(huán)境等因素會影響鉤體生存、傳播，具體的致病、傳播機制尚需進一步驗證。

Thaipadungpanit等[9]對2000-2005年泰國東北部鉤體疫情進行MLST分析，研究發(fā)現(xiàn)L.interrogans秋季群ST34為主要的優(yōu)勢克隆群。Guernier等[10]對法國波利尼西亞塔希提地區(qū)的豬、鼠、人進行鉤體檢測，研究發(fā)現(xiàn)該地區(qū)存在L.interrogans和L.borgpetersenii2個基因種和3種ST型別，其中L.interrogans是主要致病基因種，LeptospirainterrogansST140僅在豬中發(fā)現(xiàn)，L.interrogansST17和LeptospiraborgpeterseniiST149在人和豬中均檢測到。Voronina等[11]對俄羅斯29株鉤體分離株進行分析，研究發(fā)現(xiàn)該地區(qū)存在L.interrogans、L.kirschneri和L.borgpetersenii三個基因種，其中ST37、ST17、ST 199(L.interrogans)、ST110(L.kirschneri)和ST146(L.borgpetersenii)五個ST型別從時間和地域上在該地區(qū)普遍存在。Benacer 等[12]對馬來西亞半島的城市鼠類進行鉤體檢測，研究發(fā)現(xiàn)：L.interrogans為主要基因種，巴達維亞群和爪哇群為主要流行血清群，ST143和ST50為主要流行ST型別。綜合國內(nèi)、國際鉤體病文獻報道發(fā)現(xiàn)，中國以及世界的常見致病基因種為L.interrogans和L.borgpetersenii基因種，以L.interrogans基因種為主，但是不同國家和地區(qū)又同時存在一些獨特的ST型別，例如江西的主要流行型別ST1在其它國家尚未見報道。同時，中國江西鉤體菌株基因多態(tài)性較高，優(yōu)勢ST型別ST143及優(yōu)勢血清型爪哇型與馬來西亞半島的鉤體病流行型別相同，可能與同為東南亞國家，當?shù)氐牡乩砦恢谩夂蚣碍h(huán)境因素相似有一定關(guān)系，具體的詳細機制尚需進一步的實驗驗證。

本次江西鉤體菌株的血清學、分子分型研究為江西省鉤體病的分子流行病學研究提供了科學依據(jù)。