強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)韌帶組織培養(yǎng)模型的建立及腺病毒轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究*

李虎 李儒軍 曹宸喜 王白成,2 林劍浩 陶可,3**

（1.北京大學(xué)人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科關(guān)節(jié)炎診療中心，北京100044；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，北京100191；3.德國洪堡醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)骨科研究所，薩爾D-66424）

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）是一種與炎癥緊密相關(guān)的慢性進(jìn)行性結(jié)締組織疾病，以往研究證實(shí)，肌腱附著點(diǎn)異常骨化是其病變基礎(chǔ)，成纖維細(xì)胞在致炎性因子作用下的成骨轉(zhuǎn)化在AS病理性骨化病程中起重要作用[1-4]。

已有研究顯示，成纖維細(xì)胞經(jīng)過連續(xù)的二維傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞間由于缺乏有效的信息聯(lián)絡(luò)、缺乏細(xì)胞外基質(zhì)的力學(xué)刺激和空間支撐及細(xì)胞生長的常規(guī)培養(yǎng)瓶硬度明顯高于細(xì)胞外基質(zhì)等原因而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)明顯“去分化”現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞功能發(fā)生明顯變化，可觀察到細(xì)胞極性顯著增多、細(xì)胞增殖與分泌等能力降低。因而，傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)條件不能滿足重現(xiàn)細(xì)胞在體的真實(shí)生存環(huán)境[5-11]。為了解決以上問題，本研究擬通過構(gòu)建和比較AS韌帶組織體外原位（in situ）、AS韌帶成纖維細(xì)胞二維體外（in vitro）及三維水凝膠體外（in vitro）培養(yǎng)模型，并用腺病毒轉(zhuǎn)染修飾以上3種模型，旨在探索更適合的模擬AS韌帶組織體內(nèi)生存狀態(tài)的體外培養(yǎng)模型，為AS發(fā)病機(jī)制及基因治療的深入研究提供最佳的模型選擇。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM培養(yǎng)液、Opti-MEM?、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA、PBS等試劑均購于Gibco公司，人胚胎腎293T細(xì)胞、重組5型腺病毒-半乳糖苷酶基因（rAd5-lacZ）等為本實(shí)驗(yàn)室保有，Ⅱ型膠原酶、HEPES（Sigma公司），限制性內(nèi)切酶Xba1、PacⅠ、BamH1和EcoRⅠ等（Rothe公司），X-gal染色試劑盒（Rothe公司），IL-6和TNF-α的ELISA試劑盒（RD公司），Hoechst 33258、兔抗人vimentin抗體和兔抗人CD68多克隆抗體（Abcam公司），小鼠抗人β-gal抗體和Rhodamine標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗（Sigma公司），HE染液（Rothe公司），酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），激光共聚焦顯微鏡（Confocal，Olympus公司）。

1.2 髖關(guān)節(jié)韌帶組織的獲取

本實(shí)驗(yàn)所需AS人髖關(guān)節(jié)韌帶組織取自2014年9月至2016年9月北京大學(xué)人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科擬行髖關(guān)節(jié)置換的4例重度AS（髖關(guān)節(jié)強(qiáng)直）患者。所有患者均為男性，平均年齡（44.0±4.1）歲，排除骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）等疾病[1]。本研究經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并獲得所有患者的知情同意。

1.3 髖關(guān)節(jié)韌帶成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)參照本課題組已建立的方法[12，13]。隨后，按照本課題組已報(bào)道的方法[13]使用抗vimentin抗體對(duì)分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)用第2～5代細(xì)胞[2，13]。

1.4 髖關(guān)節(jié)韌帶組織塊原位、成纖維細(xì)胞體外二維貼壁和三維海藻酸鹽水凝膠培養(yǎng)模型

首先，髖關(guān)節(jié)韌帶組織原位（in situ）培養(yǎng)：借鑒Riera等[7]已建立的人半月板體外培養(yǎng)模型，結(jié)合本課題組前期制作的軟骨組織塊[14]及Liu等[15]和Evans等[16]構(gòu)建的肌肉組織塊模型進(jìn)行髖關(guān)節(jié)韌帶組織塊取材。具體操作方法：采用直徑2 mm特制取材器對(duì)新鮮髖關(guān)節(jié)周圍韌帶組織進(jìn)行打孔取材，后將圓柱狀標(biāo)本（長6 mm，直徑2 mm）置入24孔板中并加入10%胎牛血清培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

其次，建立成纖維細(xì)胞體外（in vitro）二維培養(yǎng)模型[12，13]：將上述經(jīng)鑒定的成纖維細(xì)胞經(jīng)錐蟲藍(lán)染色、計(jì)數(shù)后分別接種于96孔板（1×104/孔）、預(yù)置有多聚賴氨酸處理的蓋玻片的6孔板和75 cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行二維平面培養(yǎng)。

最后，按照本課題組已報(bào)道的方法，將成纖維細(xì)胞按2×106/ml接種于濃度為1.2%的海藻酸鹽水凝膠中，制成三維水凝膠微球培養(yǎng)模型。

組織和細(xì)胞每3 d更換1次培養(yǎng)基。使用倒置相差顯微鏡、HE染色和抗vimetin蛋白免疫組織化學(xué)染色觀察上述模型中成纖維細(xì)胞形態(tài)、分布以及細(xì)胞外基質(zhì)合成等[12-14]。

1.5 rAd5-lacZ病毒載體的制備、鑒定與滴度檢測

PCR法合成lacZ基因后，利用Invitrogen公司的TOPO定向克隆技術(shù)創(chuàng)建入門克隆pENTR/lacZ，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，挑取陽性克隆，大量擴(kuò)增并提取質(zhì)粒；入門克隆再與表達(dá)載體pAd/CMV/V5-DEST進(jìn)行同源重組反應(yīng)，得到病毒載體pAd/CMV/V5-lacZ，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后挑選陽性克隆，搖菌提取重組病毒質(zhì)粒，酶切法對(duì)上述腺病毒載體質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。采用PacⅠ內(nèi)切酶線性化后，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞得到重組腺病毒載體，陰離子柱層析法進(jìn)行純化，通過OD260法進(jìn)行滴度檢測[13-18]。

1.6 rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組

將上述純化的含rAd5-lacZ病毒液分別加入上述髖關(guān)節(jié)韌帶組織（105個(gè)細(xì)胞/組織塊/30 μl）、二維貼壁（104個(gè)細(xì)胞/孔/3 μl）和三維水凝膠微球（106個(gè)細(xì)胞/300 μl）培養(yǎng)模型，靜置1 min，加入無血清DMEM培養(yǎng)基，輕輕振蕩使病毒與組織或細(xì)胞充分接觸，1.5 h后加入10%胎牛血清培養(yǎng)基，每3 d更換1次培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至14 d。以上3種模型實(shí)驗(yàn)中均分為2組：無病毒轉(zhuǎn)染組和rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染組[13-18]。

1.7 rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染效率的檢測

本實(shí)驗(yàn)中采用X-gal活組織染色和抗β-gal免疫組織化學(xué)染色相結(jié)合，對(duì)比3種模型中rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染效率。首先，X-gal染色定性檢測rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染結(jié)果：將上述模型中經(jīng)rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染的組織或細(xì)胞標(biāo)本使用甲醛溶液固定后，加入新鮮配置的X-gal染液，于30 min、1 h、2 h光鏡下觀察并拍照[13，14]。其次，抗β-gal免疫組織化學(xué)染色定量檢測rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染效率，即計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)/光鏡下的總細(xì)胞數(shù)×100%，具體實(shí)驗(yàn)操作如下：組織和三維水凝膠標(biāo)本使用甲醛溶液常規(guī)固定后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，石蠟包埋切片，厚度為3 μm，小鼠抗人β-gal一抗液（1∶100）孵育過夜，兔抗小鼠二抗孵育30 min，DAB顯色，中性樹膠封片；二維細(xì)胞標(biāo)本抗β-gal抗體染色采用與上述1.3中抗vimentin抗體對(duì)細(xì)胞鑒定相似的方法，將熒光二抗替換成兔抗小鼠二抗孵育30 min，DAB顯色，光鏡下觀察并拍照[13，14]。以上各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.8 rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖能力檢測

rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染14 d后，分別收集組織和細(xì)胞標(biāo)本，進(jìn)行如下操作：HE染色并計(jì)數(shù)單位面積下的細(xì)胞數(shù)和Hoechst 33258 檢測細(xì)胞 DNA 含量[13，14]，來反映rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響。同樣地，分別以無病毒轉(zhuǎn)染的DNA含量為基線經(jīng)調(diào)整后，得到3種模型的DNA含量增加率。

1.9 rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染后的致炎性細(xì)胞因子分泌

rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染第13天時(shí)，更換無血清DMEM培養(yǎng)基，24 h后收集培養(yǎng)體系中的上清液，移入無菌Eppendorf管中，置入-80℃，備測。使用IL-6和TNF-α ELISA試劑盒分別檢測lacZ過表達(dá)對(duì)兩者分泌的影響。根據(jù)樣本OD260值確定樣本中IL-6和TNF-α在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的位置，進(jìn)而計(jì)算得出相應(yīng)濃度[13，17，18]。以上步驟重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3組間比較采用單因素方差分析（LSD法），組間兩兩比較采用Student t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AASS髖關(guān)節(jié)韌帶組織與細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及抗VVii--meennttiinn蛋白鑒定

AS髖關(guān)節(jié)原代細(xì)胞貼壁生長，呈長梭形，有突出的兩極，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核明顯，其間夾雜少量多角突起樣細(xì)胞。采用多次差別酶消化法和反復(fù)貼壁傳代法純化細(xì)胞，經(jīng)2次連續(xù)傳代后，95%以上細(xì)胞為長梭形成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。采用本課題組的方法[13]，對(duì)上述第2～5代細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，檢測Vimentin蛋白表達(dá)示，2種細(xì)胞抗Vimentin蛋白均呈陽性，證實(shí)分離的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞[13]。同樣地，對(duì)AS髖周關(guān)節(jié)囊韌帶組織進(jìn)行免疫熒光染色及鑒定，顯示含有大量的成纖維細(xì)胞，計(jì)數(shù)為（537±25）/mm2。

2.2 重組腺病毒載體鑒定和滴度檢測

采用酶切法對(duì)已制備的腺病毒載體質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，結(jié)果出現(xiàn)3個(gè)不同條帶，分別為完整的lacZ基因、除lacZ基因外的腺病毒載體片段及完整（或未酶切）的腺病毒載體質(zhì)粒，表明成功構(gòu)建病毒載體質(zhì)粒pAd/CMV/V5-lacZ。對(duì)已包裝純化好的重組腺病毒載體進(jìn)行滴度檢測和感染效力測定，最終得到的rAd5-lacZ滴度為每毫升1×1011病毒顆粒，病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）為10±2[13，14（]圖1）。

2.3 rAd5-lacZ對(duì) 33種不同培養(yǎng)模型的轉(zhuǎn)染效率檢測

圖1 重組腺病毒載體pAd/CMV/V5-lacZ的酶切產(chǎn)物電泳圖

采用直徑2 mm特制取材器對(duì)新鮮髖關(guān)節(jié)周圍韌帶組織進(jìn)行打孔取材（圖2），得到圓柱狀原位（in situ）培養(yǎng)標(biāo)本（長6 mm，直徑2 mm）；后置入24孔板中，分別加入30 μl rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染（lacZ組）或等量DMEM培養(yǎng)液（無病毒轉(zhuǎn)染組），14 d后行X-gal染色，大體觀察可見lacZ組呈明顯深藍(lán)色，無病毒轉(zhuǎn)染組為淡褐色（圖3）；將上述組織標(biāo)本行病理組織包埋并切片，光鏡下顯示lacZ組呈彌漫性藍(lán)色，細(xì)胞出現(xiàn)深藍(lán)色染色，為陽性反應(yīng)，無病毒轉(zhuǎn)染組為淡灰色，未見藍(lán)色著色（圖4）。隨后，對(duì)成纖維細(xì)胞2D培養(yǎng)模型在病毒轉(zhuǎn)染14 d時(shí)進(jìn)行X-gal染色，顯微鏡下顯示lacZ組呈明顯深藍(lán)色，無病毒轉(zhuǎn)染組為無色（圖5）。相似地，rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染3D成纖維細(xì)胞海藻酸鹽水凝膠微球培養(yǎng)模型14 d后也行X-gal染色，lacZ組呈明顯深藍(lán)色，無病毒轉(zhuǎn)染組為無色透明（圖6）。

上述3種培養(yǎng)模型在rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)14 d，常規(guī)行病理組織/細(xì)胞學(xué)固定，抗β-gal免疫組織化學(xué)染色（韌帶組織和3D水凝膠微球）和免疫細(xì)胞化學(xué)染色（成纖維細(xì)胞，圖7），光鏡下計(jì)數(shù)抗β-gal免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)/光鏡下的總細(xì)胞數(shù)，得出rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染 3種模型效率[13，14]，分別為 65.84%、72.26%和75.39%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.87，P＞0.05）。

2.4 rAd5-lacZ對(duì) 33種不同培養(yǎng)模型細(xì)胞增殖的影響

圖2 構(gòu)建AS髖關(guān)節(jié)韌帶組織原位培養(yǎng)模型

圖3 AS韌帶原位培養(yǎng)組織rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染及X-gal染色的大體觀察

圖4 AS韌帶原位培養(yǎng)組織rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染及X-gal染色

以相同單位rAd5-lacZ病毒量轉(zhuǎn)染上述3種模型14 d后，發(fā)現(xiàn)相同單位rAd5-lacZ病毒量轉(zhuǎn)染后，2D單層細(xì)胞培養(yǎng)模型中細(xì)胞增殖明顯，但細(xì)胞“去分化”現(xiàn)象亦最明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞極性顯著增多、細(xì)胞核及胞質(zhì)區(qū)較前縮小，而原位韌帶組織和3D水凝膠微球中細(xì)胞形態(tài)前后無明顯變化。隨后，分別以不同模型中無病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖為參照，經(jīng)調(diào)整后定量分析得到AS髖關(guān)節(jié)原位韌帶組織、3D水凝膠微球和2D單層細(xì)胞培養(yǎng)等3種模型的細(xì)胞增殖率，即（轉(zhuǎn)染第14天時(shí)的測量值/轉(zhuǎn)染開始第1天時(shí)的測量值）/（非轉(zhuǎn)染第14天時(shí)的測量值/非轉(zhuǎn)染開始第1天時(shí)的測量值），來反映rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果分別為ISCH1、ISCH1和1.31倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.21，P＜0.05）；而AS韌帶組織原位培養(yǎng)和3D水凝膠培養(yǎng)條件下的細(xì)胞增殖效率相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.71，P＞0.05）。同樣地，分別以各組無病毒轉(zhuǎn)染的DNA含量為基線經(jīng)調(diào)整后，得到3種模型的DNA含量增加率，分別為1.67、1.83和3.61，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.91，P＜0.05），而韌帶組織原位培養(yǎng)和3D水凝膠培養(yǎng)條件下的細(xì)胞DNA含量增加率相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.37，P＞0.05）。

圖5 AS韌帶成纖維細(xì)胞單層培養(yǎng)模型（2D,in vitro）的rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染及X-gal染色

圖6 成纖維細(xì)胞水凝膠接種培養(yǎng)模型（3D,in vitro）的rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染及X-gal染色

2.5 rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染對(duì)致炎性細(xì)胞因子分泌的影響

以相同單位rAd5-lacZ病毒量轉(zhuǎn)染上述3種模型13 d后，采用與細(xì)胞增殖率相同的方法[13-16]，以不同模型中無病毒轉(zhuǎn)染的IL-6或TNF-α分泌為參照經(jīng)調(diào)整后，定量分析得韌帶原位組織塊、3D水凝膠微球和2D單層細(xì)胞培養(yǎng)3種模型中的IL-6或TNF-α分泌量增加率，即（轉(zhuǎn)染第14天時(shí)的測量值/轉(zhuǎn)染開始第1天時(shí)的測量值）（/非轉(zhuǎn)染第14天時(shí)的測量值/非轉(zhuǎn)染開始第1天時(shí)的測量值），結(jié)果顯示3種模型中IL-6分泌量分別增加了5.04、1.64和ISCH0倍，TNF-α分泌量分別增加了6.88、2.17和2.14倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=282.67、350.18，P均＜0.01）；而AS韌帶組織原位培養(yǎng)和3D水凝膠培養(yǎng)條件下的IL-6及TNF-α分泌量均相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.44、1.83，P均＞0.05）。

3 討論

AS是累及中軸關(guān)節(jié)并可波及外周關(guān)節(jié)、肌腱韌帶附著點(diǎn)及其他組織的慢性炎癥性進(jìn)行性全身結(jié)締組織疾病，以骶髂關(guān)節(jié)炎、肌腱端炎和脊柱炎為特點(diǎn)。國人AS發(fā)病率為0.23%，據(jù)此估算全國約有300萬患者[1-4]。由于AS病因尚未完全明確，缺乏特異性實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及有效的治療手段，晚期病情加重時(shí)常出現(xiàn)脊柱強(qiáng)直、關(guān)節(jié)畸形，且不能逆轉(zhuǎn)，常導(dǎo)致患者功能喪失，是青壯年致殘的主要原因[1-4]。如果在AS發(fā)病初期，針對(duì)病因進(jìn)行相應(yīng)的處理，能顯著緩解其骨性強(qiáng)直的疾病進(jìn)展[19，20]。然而，已有的研究證據(jù)表明，體外細(xì)胞所處的環(huán)境與其在體內(nèi)的相差甚大，導(dǎo)致體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往與體內(nèi)的相差較遠(yuǎn)，不能完全作為臨床試驗(yàn)的可靠依據(jù)[5-8]。所以，構(gòu)建理想的AS體外培養(yǎng)研究模型，深入探索其病因，明確引起肌腱附著點(diǎn)軟組織異常鈣化骨化的細(xì)胞與致炎性細(xì)胞因子成分及相關(guān)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、藥物與基因治療靶點(diǎn)及其作用途徑顯得尤為重要。為此，本課題組在前期已建立的軟骨組織塊培養(yǎng)模型基礎(chǔ)上[14]，結(jié)合Riera等[7]的人半月板以及 Liu 等[15]和Evans等[16]構(gòu)建的肌肉組織塊體外培養(yǎng)模型，成功構(gòu)建髖關(guān)節(jié)韌帶組織原位（in situ）培養(yǎng)模型；隨后，對(duì)韌帶組織用酶消化法得單個(gè)細(xì)胞，接種于預(yù)置玻片的6孔板中，建立成纖維細(xì)胞體外（in vitro）2D培養(yǎng)模型；并將成纖維細(xì)胞按2×106/ml接種于海藻酸鹽水凝膠中，制作3D水凝膠微球培養(yǎng)模型。

在成功建立上述3種不同培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上，本課題組探索了引起肌腱附著點(diǎn)軟組織異常鈣化骨化細(xì)胞的研究。Vimentin蛋白主要存在中胚層間葉組織中，是重要的細(xì)胞骨架蛋白，常密集環(huán)繞在核周，形成波形纖維網(wǎng)，并與核膜下的層粘連蛋白相連，參與細(xì)胞的生長分化及遷移游走，常作為成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)記物用于鑒定；而CD68被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物[12，13]。本研究采用免疫熒光染色分別檢測AS髖關(guān)節(jié)韌帶組織及分離的細(xì)胞Vimentin、CD68蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示分離的第2～5代細(xì)胞抗Vimentin蛋白呈明顯陽性，CD68蛋白陰性，證實(shí)分離的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞；同樣地，AS髖關(guān)節(jié)韌帶組織進(jìn)行抗Vimentin蛋白免疫熒光染色，顯示有大量的成纖維細(xì)胞，計(jì)數(shù)為（537±25）/mm2，其間分布有少量CD68陽性的細(xì)胞，推測可能是AS韌帶組織中固有的巨噬細(xì)胞；另外也有可能是炎癥時(shí)，巨噬細(xì)胞游走于韌帶組織間隙[1-4，19，20]。以上結(jié)果也與 Yang等[2]的研究發(fā)現(xiàn)一致，均表明成纖維細(xì)胞作為關(guān)節(jié)周圍結(jié)締組織的主要細(xì)胞，可能在炎性介質(zhì)趨化作用下增殖并合成大量膠原基質(zhì)，這也是導(dǎo)致結(jié)締組織增生及纖維化進(jìn)而異常鈣化骨化的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。

圖7 免疫組織化學(xué)染色檢測rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染效率

基因治療是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，達(dá)到治療目的，被認(rèn)為是21世紀(jì)最偉大的科學(xué)工程和最重要的醫(yī)學(xué)革命之一和治療慢性疾病（如腫瘤、老年神經(jīng)退行性疾?。┳钣行У氖侄沃籟21]。由于AS病程遷延、致病機(jī)制尚未明晰且缺乏特異性的治療藥物，而基因治療通過多種病毒或非病毒的載體攜帶AS病理性骨化關(guān)鍵靶分子的抑制劑等基因?qū)胫另g帶、肌腱附著點(diǎn)成纖維細(xì)胞內(nèi)，通過直接的細(xì)胞自分泌或周圍細(xì)胞的旁分泌作用阻斷AS異常鈣化骨化的過程，達(dá)到控制AS疾病進(jìn)展的目的，為AS發(fā)病機(jī)制的探索、靶向治療新藥物的開發(fā)提供了新的思路。近年來，隨著基因治療的蓬勃發(fā)展，尤其是腺病毒臨床前臨床期安全性、有效性的不斷驗(yàn)證[22]，其也被較廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)染骨骼肌肉系統(tǒng)（如軟骨、韌帶或滑膜組織）的體內(nèi)外研究中[23]。

在此基礎(chǔ)上，本研究嘗試著使用已成功構(gòu)建的rAd5-lacZ病毒載體轉(zhuǎn)染AS韌帶原位組織塊、3D水凝膠微球和2D單層細(xì)胞培養(yǎng)3種模型，檢測病毒載體轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞增殖和致炎性細(xì)胞因子（IL-6和TNF-α）分泌等變化情況。

首先，在腺病毒轉(zhuǎn)染效率的研究中，Liu等[15]和Evans等[16]利用腺病毒攜載骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（Ad-BMP-2）能有效轉(zhuǎn)染肌肉組織塊培養(yǎng)模型，且隨著Ad-BMP-2濃度的增加，轉(zhuǎn)染效率不斷提高。本研究以相同單位rAd5-lacZ病毒量轉(zhuǎn)染上述3種模型14 d后，X-gal定性染色檢測rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染結(jié)果，光鏡下發(fā)現(xiàn)3種模型中的lacZ組均呈明顯藍(lán)色著色，為陽性反應(yīng)，無病毒轉(zhuǎn)染組未見藍(lán)色染色。抗β-gal免疫組化染色的結(jié)果顯示，rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染3種模型效率分別為65.84%、72.26%和75.39%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這也表明本課題組成功構(gòu)建的rAd5-lacZ病毒載體在體外能有效轉(zhuǎn)染3種模型，“穿透”進(jìn)入組織深層，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供可靠依據(jù)。

其次，腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)成纖維細(xì)胞增殖影響方面，Kornberg等[24]在人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，腺病毒自身具有促進(jìn)血管生成活性，能刺激細(xì)胞增殖、遷移、血管化形成和黏著斑激酶磷酸化。隨后，有學(xué)者利用Ad-綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)染大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)Ad-GFP可高效轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞，但對(duì)細(xì)胞增殖能力無明顯影響[25]。然而，也有學(xué)者將Ad-增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）導(dǎo)入鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系TCa83細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率隨時(shí)間延長逐漸下降[26]。近期，翁習(xí)生等[27]報(bào)道了腺病毒攜載增強(qiáng)綠色熒光蛋白在體外能轉(zhuǎn)染關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，對(duì)軟骨細(xì)胞表型影響較明顯，表現(xiàn)為Ⅱ型膠原合成能力明顯下降。為了探討對(duì)腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)成纖維細(xì)胞增殖影響，本研究對(duì)AS韌帶原位組織塊、3D水凝膠微球和2D單層細(xì)胞培養(yǎng)3種模型轉(zhuǎn)染相同單位rAd5-lacZ病毒量，14 d后發(fā)現(xiàn)2D單層細(xì)胞培養(yǎng)模型中細(xì)胞增殖明顯，但細(xì)胞“去分化”現(xiàn)象亦最明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞極性顯著增多、細(xì)胞核及胞質(zhì)區(qū)較前縮小，而原位韌帶組織和3D水凝膠微球中細(xì)胞形態(tài)前后無明顯變化。而rAd5-lacZ對(duì)細(xì)胞增殖效率影響方面，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染能促進(jìn)3種模型中的成纖維細(xì)胞的增殖，尤其以2D單層細(xì)胞培養(yǎng)增加最為明顯，是其余兩者的ISCH8倍，而AS韌帶組織原位培養(yǎng)和3D水凝膠培養(yǎng)條件下的細(xì)胞增殖效率相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

最后，本研究進(jìn)行了腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)成纖維細(xì)胞功能影響的研究。Gratacós等[28]研究發(fā)現(xiàn)，AS患者致炎性細(xì)胞因子（IL-6和TNF-α）水平明顯升高，且IL-6與AS疾病活動(dòng)度密切相關(guān)。隨后，Bal等[29]通過檢測血清中可溶性白細(xì)胞介素-2受體（sIL-2R）、IL-6和TNF-α的水平后，認(rèn)為IL-6和TNF-α在AS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，且其水平可作為疾病活動(dòng)度和診斷的評(píng)估工具。故在本實(shí)驗(yàn)中，本課題組采用致炎性細(xì)胞因子分泌（IL-6和TNF-α）來反映rAd5-lacZ轉(zhuǎn)染對(duì)成纖維細(xì)胞功能的影響[13]。定量分析結(jié)果顯示，3種模型中以2D單層細(xì)胞培養(yǎng)的IL-6或TNF-α分泌量增加率最高，分別達(dá)到了5.04和6.88倍，顯著高于其他2種模型中的增加率，是其余兩種模型的3.08、4.59倍和3.17、3.22倍，而AS韌帶原位組織塊培養(yǎng)和3D水凝膠培養(yǎng)條件下的IL-6或TNF-α分泌量增加相似。

本研究結(jié)果表明，韌帶組織原位培養(yǎng)和成纖維細(xì)胞3D水凝膠培養(yǎng)能更好地模擬AS韌帶成纖維細(xì)胞在體的生存環(huán)境，是較為理想的體外培養(yǎng)模型，且rAd5-lacZ能在一定時(shí)間內(nèi)（至少14 d）有效轉(zhuǎn)染以上模型，但值得注意的是，腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的增殖能力和功能狀態(tài)可能產(chǎn)生有一定的影響，應(yīng)在未來實(shí)驗(yàn)中予以重視。本研究結(jié)果為建立有效的AS韌帶體外培養(yǎng)及基因修飾模型提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。