3種人參根系分泌物的成分比較及化感效應(yīng)分析

劉成 李彩鳳 劉兵

摘要：為了比較不同品種人參耐連作能力強(qiáng)弱，探討人參連作障礙的可能機(jī)制，通過提取3個不同品種吉黃果參（R1）、邊參1號（R2）、吉參1號（R3）7年生人參根系分泌物，利用GC-MS方法對根系分泌物的主要成分進(jìn)行鑒定，并通過生物檢測驗證其化感效應(yīng)。結(jié)果表明：R1、R2、R3根系分泌物中鑒定出的化感物質(zhì)主要有酸類、醇類、酯類合胺類等，但各類化感物質(zhì)的數(shù)量和含量不同。R1、R2、R3中均鑒定出阿魏酸，相對質(zhì)量濃度分別為0.31、0.21、0.34 mg/L。所有根系分泌物和外源化感物質(zhì)阿魏酸處理，均明顯抑制人參種子的出苗率和幼苗株高、最大葉長和葉寬、根長等形態(tài)指標(biāo)，各處理對幼苗抗氧化酶、葉片光合色素、內(nèi)源激素含量均表現(xiàn)出化感毒性，但邊參1號根系分泌物化感效應(yīng)較其余處理弱，證明其抗連作能力較強(qiáng)。阿魏酸是人參根系分泌的化感自毒物質(zhì)之一。

關(guān)鍵詞：人參;根系分泌物;阿魏酸;化感效應(yīng)

中圖分類號：S567.5+10.1 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0191-05

人參為五加科人參屬植物，為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，被譽(yù)為21世紀(jì)最重要和最具發(fā)展前景的藥用作物之一。現(xiàn)代栽培的人參，是由野生人參經(jīng)長期引種馴化、栽培而形成的經(jīng)濟(jì)價值很高的作物。近年來，國家對人參產(chǎn)品藥食同源的放開，導(dǎo)致人參需求量猛增，種植面積逐年擴(kuò)大。人參忌地性非常強(qiáng)，重茬參地要30年后才能再栽參，不宜輪作。人參在中國的栽培面積和總產(chǎn)均居世界第一位，是中國用量較大的藥材之一，占據(jù)較大的出口市場份額，是傳統(tǒng)林區(qū)改制后重要的經(jīng)濟(jì)來源[1]。韓國、日本等已實現(xiàn)大田連續(xù)栽參，中國還未掌握人參連作關(guān)鍵技術(shù)。連作障礙問題制約了人參產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，栽培土地嚴(yán)重短缺，長期采用伐林栽參方式，即將森林全部砍伐后再栽參，嚴(yán)重破壞自然生態(tài)環(huán)境[2]。

化感作用就是指一個活體植物通過地上部分莖葉揮發(fā)、莖葉淋溶、根系分泌等途徑向環(huán)境中釋放一些化學(xué)物質(zhì)，從而影響周圍植物的生長和發(fā)育[3]。連作障礙一直是栽培學(xué)研究的重點，人參發(fā)生連作障礙，輕則減產(chǎn)、減收，重則絕收，嚴(yán)重制約了人參產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。人參忌連作是一個世界性的技術(shù)難題，更是長期以來困擾我國參業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的主要問題。前人研究表明，引起連作障礙的原因眾多，土壤理化性狀的變化、病原微生物及土傳病害的增加都是重要的原因，但都未從根本上揭示連作障礙的產(chǎn)生機(jī)制。研究表明化感物質(zhì)在人參連作障礙中有著重要影響，根系分泌物是人參重要的化感物質(zhì)來源，與植物的連作障礙有著重要聯(lián)系，成為眾多作物栽培學(xué)者研究的熱點。根系分泌物在植物根際對話中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，是植物響應(yīng)外界脅迫的反應(yīng)途徑，也是植物與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要載體[4-5]。有關(guān)根系分泌物筆者從收集方法、萃取途徑和化感效應(yīng)等方面進(jìn)行了前期研究[6-9]。人參根系分泌物與不同品種、生長時期、生長環(huán)境密切相關(guān)，是產(chǎn)生化感作用的重要原因[10]。

目前，有關(guān)不同品種人參根系分泌物成分的相互比較研究較少，由于人參特殊的生理特點和較長的生長周期，嚴(yán)重影響了其根系分泌物研究工作的精確性和系統(tǒng)性[11-12]。因此，本研究對3種不同抗性品種人參根系分泌物進(jìn)行對比研究，對根系分泌物成分進(jìn)行GC-MS質(zhì)譜鑒定，其中對具有較強(qiáng)化感毒性的物質(zhì)阿魏酸進(jìn)行了相對定量分析，并引入外源阿魏酸和不同品種人參根系分泌物對人參幼苗進(jìn)行生理生化測試，旨在尋找耐連作人參品種和探索人參連作障礙的形成機(jī)制，為減緩連作障礙提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2016年在吉林康美人參栽培基地進(jìn)行，日常田間栽培管理。

1.1 根系分泌物的收集

從種植基地設(shè)置的不同品種耐連作化感定位試驗中，選取連續(xù)種植7年人參品種吉黃果參、邊參1號、吉參1號地塊，分別標(biāo)記為R1、R2、R3。上述品種采用日常田間種植方式，采取苗趴（播種育苗，用苗移栽后不再移動，直至收獲）形式栽培人參，最大限度保證人參根系分泌物的原始成分不受干擾和破壞。每塊試驗地選擇3個點，每點選取人參植株5株，小心抖干凈根系附著土壤，將每點植株混合后，分別用500 mL分析純甲醇反復(fù)淋洗根系，將得到的根系分泌物 4 000 r/min 離心5 min，然后將根系分泌物的甲醇溶液在 35 ℃ 下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃真空減壓濃縮定容至10 mL，4 ℃冷藏，備用。

1.2 根系分泌物的衍生化

用氮吹儀在35 ℃下將10 mL制備好的根系分泌液風(fēng)冷吹干，并進(jìn)行硅烷衍生化。硅烷化過程參照劉應(yīng)蛟等的方法[13]，硅烷化過程在6 h內(nèi)完成。

1.3 根系分泌物的定性和定量分析

采用GC-MS方法分析鑒定。采用Agilent公司的Trace-ISQ型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定。氣相色譜和質(zhì)譜測定方法參照郭華等的方法[14]。通過GC-MS分析后得到總離子流色譜圖，采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫定性，通過計算機(jī)在檢索系統(tǒng)進(jìn)行物質(zhì)的鑒定，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)圖庫（NIST2015 & WILEY）質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫查找核對并結(jié)合人工分析進(jìn)行物質(zhì)的鑒定。

定量分析：已有研究表明阿魏酸是人參根系分泌物中重要的化感物質(zhì)，配制阿魏酸的0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mg/L 的吡啶溶液，每個梯度3次重復(fù)進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，以重復(fù)樣的峰面積平均值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，根據(jù)各組分的保留時間確定物質(zhì)的色譜峰面積，通過峰面積和質(zhì)量濃度關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算得到阿魏酸的質(zhì)量濃度。

1.4 根系分泌物原液及外源化感物質(zhì)的自毒效應(yīng)

通過生物檢測驗證人參根系分泌物對人參苗生長的影響。將按“1.1”節(jié)方法收集到的不同品種人參根系分泌物蒸餾水定量稀釋為50 mL，用細(xì)菌過濾器過濾后每24 h澆灌1次已催芽人參種子，測定發(fā)芽率，發(fā)芽率方法參照王菡等的方法[15];配制0.20 mg/L阿魏酸的甲醇溶液供后續(xù)試驗。2年生人參苗用自來水將根部泥土洗凈消毒，盡量減少對人參根部的傷害，25%多菌靈500倍液浸泡15 min，無菌水反復(fù)沖洗，種植于未受污染的新林地土中，每小區(qū)3 m2，日常田間管理方式。培養(yǎng)30 d后開始澆灌根系分泌物及外源化感物質(zhì)阿魏酸，每次每株加10 mL處理液，以甲醇為對照（CK），共5個處理，分別記作CK、R1、R2、R3、A1，每處理重復(fù)3次，每隔5 d澆灌1次處理液。60 d后調(diào)查人參株高、葉長、葉寬和須根數(shù)及測定各項生理生化指標(biāo)。計算化感效應(yīng)指數(shù)采用Williamson等的方法進(jìn)行。酶活性、光合色素含量與內(nèi)源激素測定參照李合生的植物生理學(xué)試驗指南方法[16]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參根系分泌物的成分鑒定

不同品種人參根系分泌物的總離子質(zhì)譜圖比較相似，但峰面積大小不同。對總離子質(zhì)譜圖通過計算機(jī)檢索系統(tǒng)鑒定，按照相似度大于70%、峰面積大于500 000，得到不同品種人參根系分泌物的主要物質(zhì)（表1）。各處理中剔除三烯丙基異氰脲酸酯影響，前述試驗已證明這種物質(zhì)為人參栽培所用塑料薄膜中的增塑劑分解物質(zhì);同時剔除五氯硝基苯，為殘留農(nóng)藥分解產(chǎn)物。這2種物質(zhì)不能歸類為化感物質(zhì)。

從R1、R2和R3人參根系分泌物中分別鑒定出47種、41種和48種化合物，各處理根系分泌物中以有機(jī)酸類物質(zhì)種類最多，相對豐度占比最大，R1和R3有機(jī)酸含量比R2高。在鑒定的化感物質(zhì)中，酯類、醇類占比也較大。在鑒定出的眾多化合物中，阿魏酸是已被證實是人參連作障礙中重要的化感物質(zhì)之一，從R1、R2和R3人參根系分泌物中鑒定到的阿魏酸相對豐度分別為2.59%、1.89%和2.75%。

2.2 人參根系分泌中阿魏酸的定量

根據(jù)不同質(zhì)量濃度阿魏酸GC-MS圖中峰面積和濃度的關(guān)系，建立阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，依據(jù)不同品種人參根系分泌物中阿魏酸的峰面積，計算出不同品種人參根系分泌物中阿魏酸的質(zhì)量濃度和植株分泌量（表2）。

由表2可以看出，R1和R3人參品種中阿魏酸含量高于R2人參品種中阿魏酸的含量，R1、R2和R3中阿魏酸質(zhì)量濃度分別為0.31、0.21、0.34 mg/L。

2.3 人參根系分泌物的化感效應(yīng)

2.3.1 不同品種人參根系分泌物及阿魏酸對形態(tài)指標(biāo)的影響 由表3可以看出，相對于對照，不同品種人參根系分泌物和外源阿魏酸均顯著抑制了人參種子的出苗率和人參苗的株高、最大葉長和葉寬、根長等形態(tài)指標(biāo)，其中R1和A1對出苗率和株高都達(dá)到極顯著抑制水平。阿魏酸處理對人參幼苗株高化感指數(shù)最高，達(dá)到50.08%，其次是邊參1號根系分泌物處理，化感指數(shù)達(dá)到42.28%，邊參1號根系分泌物處理對最大葉長化感指數(shù)達(dá)到40.34%。

2.3.2 人參根系分泌物處理及阿魏酸對幼苗抗氧化酶活性的影響 人參根系分泌物及阿魏酸處理對人參幼苗抗氧化酶活性的影響如表4所示。除R2外， 各處理對SOD酶活性影響均達(dá)到極顯著差異水平;R1和A1對POD酶活性影響達(dá)到極顯著差異水平，化感指數(shù)為32.30%和38.97%;R1對PAL酶活性影響最大，達(dá)到極顯著差異水平，化感指數(shù)為30.05%;A1對CAT酶活性影響最大，達(dá)到極顯著差異水平，化感指數(shù)為25.71%。

2.3.3 人參根系分泌物及阿魏酸處理對光合色素含量的影響 人參根系分泌物及阿魏酸處理對葉片光合色素含量的影響如表5所示。R1和A1對葉綠素a和葉綠素b影響均達(dá)到極顯著差異水平;除R2外，各處理對類胡蘿卜素影響均達(dá)到極顯著差異水平，化感指數(shù)分別為26.21%、29.61%、27.67%。

2.3.4 人參根系分泌物及阿魏酸處理對內(nèi)源激素含量的影響 人參根系分泌物及阿魏酸處理對人參內(nèi)源激素含量的影響如表6所示。除R2外，各處理對IAA與ABA影響均達(dá)到極顯著差異水平;R1和A1對GA3影響均達(dá)到極顯著差異水平，化感指數(shù)分別為24.64%和36.17%。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同品種人參根系分泌物化感物質(zhì)的差異

本試驗的創(chuàng)新點在于首次對比研究不同抗性品種人參根系分泌物成分區(qū)別和化感效應(yīng)，結(jié)果表明，不同品種人參根系分泌物中存在化感物質(zhì)，品種不同，根系分泌物中化感物質(zhì)種類和含量不同。連續(xù)種植導(dǎo)致減產(chǎn)或絕收的重要原因就是化感物質(zhì)對后續(xù)人參生長有強(qiáng)烈的抑制作用，根系分泌的化感毒性越強(qiáng)，連作危害越重。從本試驗可以看出，不同品種人參根系分泌物鑒定出的主要化感物質(zhì)為有機(jī)酸類、醇類、酯類，各類物質(zhì)的數(shù)量和相對含量不同，這與前人的研究結(jié)果[1]基本一致。傳統(tǒng)農(nóng)家品種邊參1號種植7年后，化感物質(zhì)種類較吉黃果參和吉參1號少，酚酸類化感物質(zhì)是公認(rèn)對連作影響較大的化感物質(zhì)，邊參1號品種在對羥基苯甲酸、阿魏酸和棕櫚酸這3種主要化感物質(zhì)含量上較其余2個品種要低，這可以理解為農(nóng)家品種邊參1號連作抗性強(qiáng)的理論依據(jù)。

3.2 不同品種人參根系分泌物及阿魏酸處理的化感效應(yīng)

不同品種人參根系分泌物及阿魏酸處理對幼苗最大葉長和最大葉寬化感指數(shù)影響不如出苗率、株高、根長明顯，可能與葉長、葉寬化感反應(yīng)不敏感有關(guān)。試驗表明，不同處理對人參種子出苗率、植株株高、最大葉長、最大葉寬、根長、須根數(shù)均表現(xiàn)出農(nóng)家品種邊參1號化感指數(shù)最小，對人參苗抗氧化酶活性及光合色素含量和內(nèi)源激素含量表現(xiàn)為邊參1號化感指數(shù)最小、其次是吉參1號，吉黃果參品種受影響最大，化感指數(shù)變化與外源酚酸阿魏酸處理表現(xiàn)出一致性，證明產(chǎn)生化感毒害作用的可能主要為酚酸類化感物質(zhì)。人參幼苗根系酶活性的升高可能是其受到化感脅迫后，導(dǎo)致體內(nèi)過氧化產(chǎn)物增多而啟動的一種應(yīng)激機(jī)制，即氧化脅迫誘導(dǎo)了人參苗體內(nèi)抗氧化能力的增加。但是，這種適應(yīng)性的反應(yīng)只在一定受害程度內(nèi)發(fā)揮作用，當(dāng)體內(nèi)過氧化產(chǎn)物積累到一定水平時，各種酶不能正常發(fā)揮作用，將會導(dǎo)致酶活性下降，這一研究結(jié)果與黃小芳等人的研究結(jié)果[17]類似。

在人參種子中，每一個生長季結(jié)束，應(yīng)盡可能除去殘留的莖、葉、根，以減少土壤中的化感物質(zhì)含量[18]，減少對來年人參生長的影響。大量研究結(jié)果表明，用甲醇做溶劑提取植物根系分泌物是一種有效的途徑，能將土壤中大量化感物質(zhì)提取出來，但該方法與自然界雨水淋溶還有一定區(qū)別，在實際大田生產(chǎn)自然環(huán)境中化感物質(zhì)還存在植株分解與土壤中微生物的參與互作2種分解途徑，還需要繼續(xù)深入研究。

本試驗只選用了3種人參根系分泌物作對比，后續(xù)試驗應(yīng)增加品種和抗性指標(biāo)測試范圍，大田條件下作物根際環(huán)境非常復(fù)雜，人參化感作用潛力是由多種因素共同作用的結(jié)果，更多因素之間的互作效應(yīng)還應(yīng)進(jìn)一步研究。

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