Klotho蛋白早期診斷嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致AKI的價值

楊銀忠，程文霞，陳敏敏，趙 鵑

(四川省人民醫(yī)院東院檢驗(yàn)科，四川成都 610101)

近年來，隨著我國城市建設(shè)及社會的飛速發(fā)展，車禍傷、高墜傷、打擊傷等創(chuàng)傷已嚴(yán)重威脅人類的生命安全，急性腎損傷(AKI)是嚴(yán)重創(chuàng)傷后臨床常見的并發(fā)癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，嚴(yán)重創(chuàng)傷后AKI發(fā)生率為30%～50%,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，病死率可高達(dá)29%～90%[1-2]。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測腎損傷的指標(biāo)主要有血肌酐(Scr)和尿量等，以估測腎損傷程度，但這些指標(biāo)異常時患者腎實(shí)質(zhì)有可能已發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)損傷。目前，早期診斷AKI尚不理想，因此，尋找快速、便捷、靈敏度和特異度高的生物學(xué)標(biāo)志物對預(yù)測及早期診斷意義重大。Klotho 蛋白是體內(nèi)Klotho基因編碼的一種單向跨膜蛋白，主要在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)。有研究表明，在早期腎損傷時Klotho等基因表達(dá)改變，Klotho蛋白在血漿中水平較高，但在正常細(xì)胞及腎損傷修復(fù)后水平均較低，是反映AKI的一種理想標(biāo)志物[3-4]。本研究通過觀察嚴(yán)重創(chuàng)傷后AKI患者血清Klotho蛋白水平的動態(tài)變化，旨在探討該血清標(biāo)志物早期診斷AKI的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年3-12月該院重癥監(jiān)護(hù)室收治的嚴(yán)重創(chuàng)傷后1周內(nèi)發(fā)生AKI患者43例作為AKI 組，其中男23例，女20例；平均(38.22±8.91)歲。車禍傷25例，高墜傷7例，擠壓傷5例，刀刺傷3例，其他傷3例。排除既往有慢性腎臟病史、正在服用免疫類或糖皮質(zhì)激素類藥物和存在惡性腫瘤等基礎(chǔ)疾病患者。選擇年齡、性別、病因及手術(shù)方式與AKI組相匹配的40例創(chuàng)傷非AKI (NAKI)患者作為NAKI組，其中男21例，女19例；平均(38.23±8.01)歲。再隨機(jī)選擇健康對照組40例，其中男20例，女20例；平均(37.7±7.43)歲。各組研究對象性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有診斷為AKI的病例均符合2005年急性腎損傷網(wǎng)絡(luò)(AKIN)和2002急性透析質(zhì)量倡議(ADQI)推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)：48 h內(nèi)腎功能突然下降，血肌酐(Scr)絕對值增加≥26.4 μmol/L或達(dá)到基線值的1.5倍或尿量<0.5 mL/(kg·h)且持續(xù)超過6 h。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，符合醫(yī)學(xué)倫理要求。

1.2樣本收集和指標(biāo)測定

1.2.1樣本收集 收集患者術(shù)前(入院15 min內(nèi)),術(shù)后2、4、6 h的血液樣本各4 mL，4 000 r/min離心1 min取上清液進(jìn)行檢測。

1.2.2Klotho蛋白檢測 采用美國Cusabio公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按試劑盒說明書制定的操作規(guī)程進(jìn)行操作，其實(shí)驗(yàn)原理為用純化的抗體包被微孔制成固相載體，往包被抗Klotho蛋白抗體的微孔中依次加入標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗Klotho蛋白抗體、HRP標(biāo)記的親和素等，經(jīng)徹底洗滌后底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，顏色深淺與樣本中Klotho蛋白量呈正相關(guān)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度，計(jì)算樣本濃度。

1.2.3Scr檢測 采用九強(qiáng)公司生產(chǎn)的肌氨酸氧化酶法試劑盒，采用美國Beckman-Coulter 5800全自動生化儀進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1各組研究對象Klotho蛋白水平比較 AKI組患者術(shù)前(入院15 min內(nèi))，術(shù)后2、4、6 h Klotho蛋白水平與NAKI組與健康對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AKI患者術(shù)前(入院15 min內(nèi))Klotho蛋白水平升高，術(shù)后2、4、6 h逐漸下降。見表1。AKI組患者各時間點(diǎn)Scr水平比較及與NAKI組和健康對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組研究對象Klotho蛋白水平比較

注：-表示無數(shù)據(jù)

表2 AKI與和對照組Scr的檢查水平及比較

注：-表示無數(shù)據(jù)

2.2Klotho蛋白的診斷效能 Klotho蛋白在術(shù)前(入院15 min內(nèi))，術(shù)后2、4、6 h的受試者工作特征曲線(ROC)曲線下面積(AUC)分別為0.955、1.000、1.000、1.000，Klotho蛋白在術(shù)前(入院15 min內(nèi))，2、4、6 h的臨床診斷臨界點(diǎn)分別為0.122、0.165、0.144、0.101 ng/mL。見圖1、表3。

圖1 ROC曲線圖

時間AUCSDP95%CI術(shù)前(入院15 min內(nèi))0.9550.0320.0000.892～1.000術(shù)后2 h1.0000.0000.0001.000～1.000術(shù)后4 h1.0000.0000.0001.000～1.000術(shù)后6 h1.0000.0000.0001.000～1.000

3 討 論

Klotho蛋白最初是在1997年由韓國科學(xué)家Kuroo在抗衰老研究中被發(fā)現(xiàn)的，其是體內(nèi)Klotho基因編碼的一種單向跨膜蛋白，主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞中，可在血液及尿液中檢查到。近年來，HU等[5]研究表明，在AKI大鼠和小鼠中隨腎功能損傷的進(jìn)展，腎臟、血液和尿液中Klotho蛋白水平均顯著減低，當(dāng)腎功能恢復(fù)后體液和組織中Klotho蛋白水平又可恢復(fù)到正常水平。在研究AKI患者的尿液時也發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白水平顯著減低，提示AKI是一種Klotho蛋白缺失的急性、暫時性病理狀態(tài)[6]。同時，有研究表明，Klotho蛋白缺陷可加重缺血再灌注導(dǎo)致的組織損傷，而Klotho蛋白的過表達(dá)可緩解損傷，進(jìn)一步證明Klotho蛋白表達(dá)變化在臟器缺血再灌注損傷的病理生理過程中具有重要作用，其有可能作為診斷AKI的一個新的標(biāo)志物。目前，嚴(yán)重創(chuàng)傷后AKI相關(guān)Klotho蛋白指標(biāo)的動態(tài)變化尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

當(dāng)患者發(fā)生嚴(yán)重創(chuàng)傷后腎臟是最易受累的器官之一，在創(chuàng)傷失血、臟器受損和休克等多種因素作用下，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，直接導(dǎo)致腎臟血流量灌注不足或缺血，從而引起腎組織損傷，導(dǎo)致AKI的發(fā)生。有研究表明，創(chuàng)傷后發(fā)生AKI的原因與炎癥介質(zhì)過度活化和表達(dá)密切相關(guān)，在受損早期腎臟會及時自我維護(hù)及修復(fù)，包括早期阻止炎癥細(xì)胞活化及炎癥介質(zhì)的釋放等[7]。

目前，有研究表明，Klotho蛋白具有調(diào)節(jié)細(xì)胞表面多種糖蛋白的激素樣因子功能，如上調(diào)熱休克蛋白70表達(dá)等，提高抗凋亡蛋白穩(wěn)定性和間接抑制氧化應(yīng)激，通過抑制細(xì)胞內(nèi)相關(guān)傳導(dǎo)信號，上調(diào)抗氧化酶類的表達(dá)，在阻止早期炎癥細(xì)胞活化和炎癥介質(zhì)釋放方面具有一定作用[5-6]。因此，當(dāng)機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致AKI后腎組織細(xì)胞凋亡導(dǎo)致Klotho蛋白表達(dá)下調(diào)，Klotho蛋白則作為一種激素樣因子發(fā)揮抗凋亡、抗炎、抗氧化等作用，從而導(dǎo)致血液濃度發(fā)生相應(yīng)改變。本研究通過比較AKI組、NAKI組和健康對照組研究對象血清Klotho蛋白發(fā)現(xiàn)，AKI組患者Klotho蛋白水平術(shù)前(入院15 min內(nèi))，術(shù)后2、4、6 h均明顯高于NAKI組和健康對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但各組研究對象Scr水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明AKI患者術(shù)前(入院15 min內(nèi))及術(shù)后6 h內(nèi)Klotho蛋白水平變化比Scr更早，對AKI的早期診斷價值明顯優(yōu)于Scr，與相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基本吻合[4-6]。

本研究在不同時間點(diǎn)AKI組患者Klotho蛋白檢測結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，患者Klotho蛋白水平術(shù)前(入院15 min內(nèi))已升高，術(shù)后2、4、6 h逐漸下降，而術(shù)后6 h內(nèi)Scr水平無多大變化，表明Klotho蛋白是預(yù)測嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致腎損傷早期診斷的良好指標(biāo)，其次Klotho蛋白也可能與腎臟的修復(fù)具有一定關(guān)系[4]。但本研究與大鼠等動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果具有一定差別[5-6]，大鼠實(shí)驗(yàn)組在創(chuàng)傷2 h后再逐漸降低，而本研究是AKI患者入院后就檢測到升高再逐漸降低，可能是本研究所選擇的AKI患者均為嚴(yán)重創(chuàng)傷患者和入院時間等因素有關(guān)。

目前，國內(nèi)研究[4-8]和國外研究[9]探討了在心臟術(shù)后引起急性缺血再灌注導(dǎo)致AKI時Klotho蛋白的變化，但尚未查閱到其他原因?qū)е翧KI時Klotho蛋白變化的文獻(xiàn)。通過本研究和在心臟術(shù)后導(dǎo)致AKI的文獻(xiàn)比較后發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白均有可能作為AKI標(biāo)志物的價值，但本研究Klotho蛋白變化的時間比其他文獻(xiàn)報(bào)道更早，可能與本研究AKI組患者創(chuàng)傷均較嚴(yán)重和就診時間等有關(guān)?？紤]到本研究僅為小樣本單中心研究，故未來尚需多中心和多樣本進(jìn)行前瞻性研究，并評估其診斷價值。

4 結(jié) 論

AKI患者Klotho蛋白水平術(shù)前(入院15 min內(nèi))已升高，術(shù)后2、4、6 h逐漸下降，而術(shù)后6 h內(nèi)Scr水平無多大變化，表明Klotho蛋白是預(yù)測嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致腎損傷早期診斷的良好指標(biāo)。檢查Klotho蛋白有助于早期診斷嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致AKI，可作為早期診斷的標(biāo)志物。