木犀草素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞抑癌基因RECK表達(dá)的影響及機(jī)制研究

魏付橋 陽(yáng)樂彬 王春云 鄧豪 唐金濤 謝文彪

421001南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科，湖南 衡陽(yáng)

結(jié)直腸癌是胃腸外科最常見的惡性腫瘤。隨著我國(guó)人民生活水平的提高，蛋白攝入量日益增多，近年來(lái)結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐漸增高。因此開展本病研究有利于提高本病的治愈水平。和其他惡性腫瘤一樣，結(jié)直腸癌的發(fā)病也是細(xì)胞增殖與凋亡失調(diào)的結(jié)果，從基因角度來(lái)說(shuō)，涉及癌基因與抑癌基因的改變。RECK 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型抑癌基因，在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中，RECK 呈低表達(dá)或不表達(dá)，且在腫瘤細(xì)胞中其基因啟動(dòng)子區(qū)域呈甲基化而失活[1]。此外，RECK 也與腫瘤的侵襲性呈負(fù)相關(guān)。因此，采用藥物干預(yù)，提高其表達(dá)水平，是治療結(jié)直腸癌的重要思路。本研究旨在探討木犀草素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞抑癌基因RECK 表達(dá)的影響，并初步探討其機(jī)制。

資料與方法

主要實(shí)驗(yàn)材料：人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116 源自美國(guó)ATCC。鼠抗人RECK多克隆抗體、RECK 引物由上海生工合成。RNA提取試劑盒、定量PCR試劑盒。DNMT1活性試劑盒，Sp1活性試劑盒。

細(xì)胞培養(yǎng)與處理：將HCT116 細(xì)胞用DMEM(Hyclone)培養(yǎng)基中，含有10%(V/V)胎牛血清，以及100 U/mL 青霉素G和100 μg/mL 鏈霉素的培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞處理前先調(diào)整其密度為5×104/mL，隨后根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⒓?xì)胞接種于96孔板或6孔板中，12～24 h后加入終濃度為5、10和20 μmol/L木犀草素作用不同時(shí)間。

Western blot 檢測(cè)RECk 蛋白表達(dá)：用含有蛋白酶抑制劑混合物和PMSF的裂解緩沖液裂解。測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后。蛋白經(jīng)10%～15%SDS-PAGE 分離并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。室溫下用含5%脫脂奶粉封閉膜1 h，然后與一抗在4℃溫育過(guò)夜。最后將膜與HRP 標(biāo)記的二抗溫育1 h，最后化學(xué)發(fā)光、顯影，并計(jì)算灰度值。

定量PCR 檢測(cè)RECK mRNA 表達(dá)：采用Roche LightCycle 480 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR。RT-PCR 的初始步驟在50℃2 min，隨后95℃下進(jìn)行10 min 后，進(jìn)入40 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)：95℃15 s，然后在60℃退火1 min。最后60℃1 min。計(jì)算所有樣品的Ct值，并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1 和Sp1 活性分析：獲取處理后的HCT116 細(xì)胞提取核蛋白，測(cè)定其蛋白濃度后，分別測(cè)定DNMT1 和Sp1 的活性。該試劑盒上包被有Dnmt 或Sp1 吸附基質(zhì)，樣品中的Dnmt1 或Sp1 結(jié)合到基質(zhì)上，能被特異性的抗體識(shí)別，可通過(guò)ELISA法測(cè)定其吸光度，活性與顯色程度呈線性關(guān)系。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，所有結(jié)果重復(fù)3 次。組間比較采用方差分析后用SNQ 法進(jìn)行兩兩比較；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

不同濃度木犀草素上調(diào)RECK 蛋白表達(dá)：Western blot 結(jié)果顯示，對(duì)照組RECK 的灰度值為(0.12±0.04)，經(jīng)5、10和20 μmol/L 木犀草素處理后，灰度值分別為(0.22±0.04)、(0.34±0.01)和(0.42±0.02)。與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

不同濃度木犀草素上調(diào)RECK mRNA表達(dá)：實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果顯示，5、10和20 μmol/L 木犀草素處理后，RECK mRNA 的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.15±0.02)、(1.67±0.03)和(2.68±0.05)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

不同濃度木犀草素抑制人DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)表達(dá)：對(duì)照組DNMT1活性較高。5、10和20 μmol/L木犀草素處理后，酶活性分別為對(duì)照組的(91±3.14)%、(84.6±4.16)%和(75.3±2.61)%。與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

不同濃度木犀草素抑制Sp1 活性：ELISA 方法結(jié)果也顯示，HCT116 細(xì)胞靜息狀態(tài)下Sp1 活性較高。給予不同濃度木犀草素孵育24 h 后，隨著木犀草素濃度的增高，Sp1活性逐漸降低。

討 論

RECK 基因是近年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑癌基因，其主要功能是能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。研究表明，RECK 的表達(dá)水平與惡性腫瘤患者的生存率呈明顯的正相關(guān)。RECK 通常在身體的所有細(xì)胞中表達(dá)，在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的生成與降解中起著重要作用。RECK 是基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制劑，后者可分解細(xì)胞外基質(zhì)，并能促進(jìn)新生血管的形成[2]。而ECM 的降解和新血管的動(dòng)員是腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的必備條件。若腫瘤在這些功能方面受到抑制，腫瘤將停止生長(zhǎng)。因此，RECK 是一種潛在的抑制劑，也是早期臨床階段可用的預(yù)后標(biāo)志物。木犀草素是植物中的一種天然黃酮類化合物。富含木犀草素的蔬菜和水果包括胡蘿卜、花椰菜、洋蔥葉、歐芹、芹菜、甜椒和菊花。木犀草素具有很強(qiáng)的抗癌、抗炎和抗氧化活性，在許多類型的癌細(xì)胞中可以逆轉(zhuǎn)多藥耐藥(MDR)。它還可以改善各種化療藥物可能引起的細(xì)胞毒性[3]。盡管木犀草素有很好的抗癌特性，但它們的確切作用還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素不但可上調(diào)RECK 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平，同時(shí)也能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)DNMT1 和核轉(zhuǎn)錄因子Sp1 的活性，后者是介導(dǎo)DNA 甲基化的重要分子。木犀草素對(duì)甲基化的抑制，能有效改善RECK 的甲基化狀態(tài)，從而激活并重新誘導(dǎo)RECK 表達(dá)，最終發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移的抑制作用。在未來(lái)的研究中，將對(duì)其作用機(jī)制開展進(jìn)一步探討。

攻讀經(jīng)典 力求實(shí)用

中醫(yī)人讀書要廣泛涉獵。中醫(yī)的思想受佛、道兩家思想的影響，尤其是佛家的思想?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》包含《素問(wèn)》《靈樞》兩個(gè)部分，《靈樞》《素問(wèn)》都包含八十一篇?！峨y經(jīng)》也是八十一篇，這些都是受佛教的影響。佛教認(rèn)為，人生要度過(guò)八十一個(gè)關(guān)口，《西游記》中唐玄奘也是經(jīng)歷了八十一難才取回了佛教真經(jīng)。而佛教思想也滲透到了醫(yī)學(xué)、藥學(xué)的領(lǐng)域，比如君主之官、相傅之官雖然都是外界詞匯，但卻滲入了中醫(yī)學(xué)說(shuō)中。

在讀經(jīng)典文獻(xiàn)時(shí)，不能死記硬背，應(yīng)該活學(xué)活用。“一寸光陰一寸金，寸金難買寸光陰”，要把時(shí)間用到研讀重要的文獻(xiàn)中去。在研讀經(jīng)典的過(guò)程中，要注意各個(gè)經(jīng)典的結(jié)合，把死書讀活，才能有所收獲，否則就是浪費(fèi)時(shí)間。除此之外，在讀經(jīng)典時(shí)，不能浮光掠影、走馬觀花的讀書，要一字一句地認(rèn)真研讀。

有些人不重視《神農(nóng)本草經(jīng)》。《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載了許多藥物性能，但許多人認(rèn)為它過(guò)時(shí)了，其實(shí)不然，《神農(nóng)本草經(jīng)》才是認(rèn)識(shí)藥物性能的關(guān)鍵。以人參為例，1957年，筆者在靈巖寺給學(xué)生講《傷寒》《金匱要略》時(shí)，講到了人參湯可生津止渴，而大家平時(shí)了解的人參都是溫陽(yáng)的。原來(lái)這種止渴的人參是山西黨參而非東北人參，這種差異在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。如果不讀《神農(nóng)本草經(jīng)》，就無(wú)法了解到這一點(diǎn)。

讀《黃帝內(nèi)經(jīng)》時(shí)，要重點(diǎn)汲取《黃帝內(nèi)經(jīng)》的精華部分，先瀏覽，尋其精華，熟稔于心。但也不能被其束縛住，讀時(shí)應(yīng)當(dāng)安心定神，“進(jìn)得去，又能出得來(lái)”。

《傷寒論》為必讀之書，歷代單注解《傷寒論》的著作就有六百多本。筆者主張要讀原文先不看注解，這樣就不會(huì)讓注解中他人的思想先入為主，影響自己的思考?！秱摗吩诹鱾?、整理及印刷的過(guò)程都有可能出現(xiàn)許多錯(cuò)字和張冠李戴現(xiàn)象，給后人學(xué)習(xí)研究造成困難。又如六經(jīng)提綱中，太陽(yáng)病表證與其他疾病有相似之處，然而給溫病戴上太陽(yáng)病的帽子是不合適的。再如書中三陰三陽(yáng)、六經(jīng)學(xué)說(shuō)概念歷代學(xué)者幾百年?duì)幷摬恍荩速M(fèi)幾多光陰。而要做的就是辨證施治，力求實(shí)用，能夠跳出三界外不在五行中，把死書用活。

讀書還要注重其實(shí)用性。大家要熟練運(yùn)用經(jīng)典中的方藥，《傷寒論》中112張?zhí)幏揭车脻L瓜爛熟，達(dá)到信手拈來(lái)的境界，且要注意用藥規(guī)律和特點(diǎn)。例如甘草，《傷寒論》中寫到甘草90%為炙甘草，而《金匱要略》中則用生甘草。如葛根，有解肌發(fā)表、升陽(yáng)舉陷、舒經(jīng)活絡(luò)、解酒毒的功效，亦可治療項(xiàng)背強(qiáng)幾幾，不過(guò)應(yīng)當(dāng)注意僅在無(wú)汗時(shí)可用。如黨參，可以止渴，然《傷寒論》《金匱要略》中并不是黨參一家。如附子，可溫理祛寒、溫陽(yáng)，用時(shí)要注意是生附子還是熟附子。