比較多種細胞因子對培養(yǎng)的黑素細胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影響

鮑華燁

310000杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科

色素性疾病(包括色素沉著及色素減退疾病)是臨床中最常見的皮膚病大類之一，其具體的發(fā)病機理尚不十分清楚，而黑素細胞已被公認為決定皮膚顏色的關鍵因素之一。黑素細胞的培養(yǎng)在研究色素性皮膚疾病中顯得極其重要。大量研究表明，某些細胞因子對黑素細胞生物學活性有重要調(diào)控作用。既往研究顯示，α-黑素細胞刺激素(α-MSH)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、內(nèi)皮素-1(ET-1)及干細胞生長因子(SCF)對黑素細胞的增殖、活性均有重要影響?；诖耍狙芯繑M探究不同濃度的4種細胞因子對體外培養(yǎng)黑素細胞的影響，構建正常人表皮黑素細胞體外培養(yǎng)體系，分析α-MSH、bFGF、ET-1及SCF與黑素細胞的增殖、黑素的合成以及酪氨酸酶活性的關系，為臨床應用提供可靠的試驗依據(jù)。

資料與方法

材料和儀器：LDopa、Ham F-12培養(yǎng)基、人轉鐵蛋白、bFGF、牛胰島素、SCF、ET-1、α-MSH、DMSO及MTT均購自美國Sigma公司，10%新生小牛血清和EDTANa2均購自美國Gibco公司，牛垂體提取物(BPE購于美國Invitrogen公司。青霉素100 IU/mL，氫化可的松0.5 mg/L，鏈霉素100 IU/mL，苔盼藍，胰蛋白酶均系國內(nèi)產(chǎn)品。培養(yǎng)瓶、96孔板和6孔板均購于美國Corning公司。Wellscan MK3型酶標儀(Labsystems公司)。 SYBR?Premix Ex TaqTM(日 本TaKaRa公司)，2 倍 Taq Master Mix(美國OMEGA公司)， MTS試 劑 盒 (美國OMEGA公司)。CFX96實時熒光定量PCR儀系美國Bio-Rad公司，梯度PCR儀購于德國Eppendorf公司。引物均由上海生工生物有限公司合成。經(jīng)患者知情同意后，標本取自18～36歲行包皮環(huán)切術的健康成人包皮。

方法：①細胞培養(yǎng)：按照Halaban方法進行[1]。簡述如下：取環(huán)切術切下的包皮，去除皮下組織，Dispase酶4℃消化過夜，將其表、真皮分離，用0.02%EDTA+0.25%胰酶消化表皮15 min，將其接種于培養(yǎng)瓶中以10個/cm2細胞密度。使用TICVA培養(yǎng)基于5%CO2、37℃條件下常規(guī)培養(yǎng)。第2天更換培養(yǎng)基，之后保持3次/周的更換頻率進行培養(yǎng)基的更換。接種后的黑素細胞鋪滿培養(yǎng)瓶的瓶底時進行傳代培養(yǎng)。進行試驗取第3～4代的細胞，在試驗過程中選用的培養(yǎng)基不含BIMX和TPA。

細胞增殖的測定：采用MTT法測定黑素細胞的增殖[2]，分成α-MSH、bFGF、ET-1及SCF及單純培養(yǎng)基各組，將其接種于96孔板中，每孔向里面加入約100μL培養(yǎng)基，然后向里面加入20μL MTT(C=5 mg/mL)，經(jīng)4 h孵育后棄去上清液，然后向里面加入20μL DMSO將其溶解，然后置于室溫條件下震蕩15 min，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm處吸光值(A值)。每組設8個復孔。以藥物處理組A490/對照組A490的百分數(shù)表示細胞增殖率。

細胞酪氨酸酶活性測定：分成α-MSH、bFGF、ET-1及SCF及單純培養(yǎng)基各組，將其接種于96孔板中，每孔向里面加入約100μL培養(yǎng)基，然后向里面加入20μL MTT(C=5 mg/mL)，經(jīng)4 h孵育后棄去上清液，然后向里面加入20μL DMSO將其溶解，然后置于室溫條件下震蕩15 min，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm處吸光值(A值)。每組設8個復孔。用藥物處理組A490/對照組A490的百分數(shù)表示酪氨酸酶活性。

細胞黑素含量測定：分成α-MSH、bFGF、ET-1及SCF及單純培養(yǎng)基各組，將其接種于96孔板中，每孔向里面加入約100μL培養(yǎng)基，然后向里面加入20 μL MTT(C=5 mg/mL)，經(jīng)4 h孵育后棄去上清液，然后向里面加入20μL DMSO將其溶解，然后置于室溫條件下震蕩15 min，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm處吸光值(A值)。每組設8個復孔。黑素含量用藥物處理組A490/對照組A490的百分數(shù)表示。

研究細胞酪氨酸酶、酪氨酸酶相關蛋白-1(TRP-1)mRNA表達水平：將細胞按照5×105/mL的濃度接種到6孔板中，1 d后依次選用4種細胞因子和新鮮培養(yǎng)基進行1次換液處理，72 h后收集細胞。按照Trizol說明書分別提取各細胞總RNA，測定RNA純度和濃度采用紫外分光光度計。逆轉錄制備cDNA，RT反應條件：65℃10 min，55℃30 min，85℃5 min。PCR擴增。反應完成之后，稱取反應液進行電泳處理，同時對其PCR產(chǎn)物加以確認。PCR擴增。real-time PCR樣品經(jīng)95℃預變性30 s后，按95℃5 s、60℃30 s進行40個循環(huán)，每個循環(huán)結束之前，對其熒光產(chǎn)物的量經(jīng)由Light-Cycle系統(tǒng)自行檢測。然后經(jīng)由實時熒光定量PCR儀上獲取到溶解、擴增曲線和Ct值。GAPDH基因引物(363bp)序列：F 5 "-TCTCCAGAACATCATCCCTGCC-3 "；TYR基因引物(705bp)序列：F5 "-TTGTGAGGACTAGAGGAAGAATGCT-3 "； R 5 "-TCATCTCCTGTCAGCTTCTGGA-3 "；R 5 "-CCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3 "。

流式細胞術檢測：細胞培養(yǎng)以后，依照2×105/孔將其轉接到6孔板中，濃度100μg/L的α-MSH、bFGF、ET-1及SCF各處理組和單純培養(yǎng)基對照組，對細胞進行72 h處理后收集各處理組的上清液，將其置于離心管中，然后向里面加入0.25%的胰蛋白酶消化貼壁細胞(不含EDTA)，然后進行懸液的收集并將其轉移到與之相對應的上清液的離心管中，以1 500 r/min行離心處理，離心時長3 min，完成后將上清液棄去，向里面加入無菌PBS重懸細胞團塊，以同樣條件進行離心處理，重復3次之后，將上清液棄去，向里面加入PI溶液，將其在室溫條件下暗處孵育0.5 h，完成后行上機檢測。

統(tǒng)計學分析：所測數(shù)據(jù)采用成組t檢驗，使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及分析。

結 果

對黑素細胞增殖的影響：SCF試驗組和單純培養(yǎng)基組相比，黑素細胞的增殖未見明顯的變化，兩者差異無統(tǒng)計學意義。而bFGF、ET-1、α-MSH各試驗組均比單純培養(yǎng)基組黑素細胞增殖明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，該結果表明bFGF、ET-1、α-MSH均可刺激黑素細胞的增殖。

對黑素細胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影響：加入bFGF和ET-1的各組黑素細胞明顯增強了酪氨酸酶活性和合成黑素能力，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。且bFGF和ET-1也能明顯促進黑素合成(P＜0.05)，激活酪氨酸酶(P＜0.01)。而 SCF、α-MSH 作用后，黑素細胞合成黑素能力增強，P＞0.05差異無統(tǒng)計學無意義，與對照組相比細胞的酪氨酸酶活性在統(tǒng)計學上差異無統(tǒng)計學意義。

對黑素細胞酪氨酸酶、TRP-1 mRNA表達的影響：bFGF、SCF、ET-1、α-MSH 4種細胞因子作用于黑素細胞72 h后，黑素細胞酪氨酸酶和TRP-1 mRNA的表達均比空白培養(yǎng)基組的表達增加顯著(P＜0.05)。其中bFGF試驗組酪氨酸酶和TRP-1 mRNA的表達較其他3組表達略增多，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

黑素細胞凋亡率：bFGF、SCF、ET-1、α-MSH作用于黑素細胞72 h后用流式細胞術檢測各組黑素細胞凋亡率分別為5.1%、5.6%、4.9%、5.5%，空白培養(yǎng)基組黑素細胞凋亡率6.8%，組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

討 論

既往研究表明，bFGF、SCF、ET-1、α-MSH、肝細胞生長因子(HGF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等多種細胞因子影響黑素細胞的功能[3]。在本研究中，我們選取4種公認的細胞因子，系統(tǒng)比較了該4種細胞因子對黑素細胞和酪氨酸酶的影響。酪氨酸酶作為合成黑素過程中最為重要的一種酶直接關系著黑素的合成。而TRP-1作為黑素體膜上的一種糖蛋白，有非常重要的作用，其能阻止未成熟的黑素細胞死亡，在黑素合成過程中起到非常重要的調(diào)節(jié)作用[4]。抑制該基因以后會抑制黑素細胞的增生，使酪氨酸酶活性下降[5]。

本研究的結果表明，bFGF、ET-1、α-MSH均可刺激黑素細胞的增殖，并且bFGF和ET-1均能提高酪氨酸酶活性，加速黑素合成。而SCF對黑素細胞的增殖無顯著影響，SCF和α-MSH對黑素細胞合成黑素能力及酪氨酸酶活性均無明顯作用。對黑素細胞的凋亡均無顯著影響是bFGF、SCF、ET-1、α-MSH 4種細胞因子。黑素細胞的生長受細胞因子、角質(zhì)形成細胞與黑素細胞間連接等多種因素調(diào)控。bFGF是成纖維細胞的一種有絲分裂原，主要作用在來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的組織細胞。研究還發(fā)現(xiàn)角質(zhì)形成細胞、細胞因子以及黑素細胞間連接等因素與黑素細胞的生長有著緊密的關聯(lián)。而bFGF作為成纖維細胞的一種有絲分裂原，其大多來源于神經(jīng)外胚層和中胚層的組織細胞。相關研究顯示，該細胞因子借助磷酸化的黏著斑激酶能夠促進黑素細胞發(fā)生遷移[6]。α-MSH作為肽類激素的一種，其在黑素細胞的分裂過程中發(fā)揮重要的作用，該物質(zhì)的前體是前阿片黑素細胞皮質(zhì)激素，其對黑素的影響主要通過和MC1R發(fā)生結合后借助cAMP信號通路發(fā)揮效用。

本研究提示，bFGF、SCF、ET-1、α-MSH均可影響黑素細胞的生長和增殖，其中ET-1和bFGF都對酪氨酸酶的活性以及黑素細胞的增殖有一定的促進作用。但是對其具體作用機制還不是很了解，有待進一步研究。