病毒性腦炎患兒細(xì)胞因子和免疫功能的臨床研究

王躍生 張 敬 李小芹

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院，河南 鄭州 450003

病毒性腦炎(viral encephalitis，VE)是兒童最多見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病之一。各種病毒均可引起的急性顱內(nèi)炎癥，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、顱內(nèi)壓增高、部分神經(jīng)功能缺損、意識不同程度障礙、癲癇及驚厥發(fā)作，其病情輕重差異較大[1-2]。病毒感染機(jī)體后，多種免疫細(xì)胞應(yīng)答活化，激活的淋巴免疫細(xì)胞經(jīng)損傷的血腦屏障侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞受到感染后與淋巴細(xì)胞共同釋放大量細(xì)胞因子，從而介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥反應(yīng)[3]，早期發(fā)現(xiàn)合理診治尤為重要[4]。本研究主要分析病毒性腦炎患兒體內(nèi)細(xì)胞因子水平、細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，從而揭示腸道病毒感染后對機(jī)體的影響。

1 對象與方法

1．1研究對象選擇2014-05—2017-05在鄭州兒童醫(yī)院消化科住院患兒60例，入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡：1～5歲；②入選患兒病史及輔助檢查均診斷為病毒性腦炎[5]，且發(fā)病在急性期(發(fā)病8d以內(nèi))臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、嘔吐、精神差、抽搐等癥狀。③確診病毒性腹瀉病例：在腹瀉糞便標(biāo)本中檢測出輪狀病毒、杯狀病毒、星狀病毒、腸道腺病毒。④排除嚴(yán)重心肺疾患，或有嚴(yán)重的腦外傷，或有嚴(yán)重免疫缺陷及既往有腦損傷病史或神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。分為單純腸道病毒感染患兒30例、合并病毒性腦炎患兒30例。男39例，女21例，平均年齡(4.1±1.2)歲；比較2組患兒在入院病情嚴(yán)重程度、年齡、性別方面，差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1．2測定指標(biāo)及方法

1．2．1 測定指標(biāo)：測定2組患兒第1、14天外周血IL-2、IL-6、TNF-α水平，流式細(xì)胞儀檢測CD3+T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，NK細(xì)胞相對活性，外周血CD4+/CD8+比值。

1．2．2 測定細(xì)胞因子：清晨空腹采集患兒治療第1、14天靜脈血2 mL，離心機(jī)分離血清后，使用ELISA方法，進(jìn)行IL-2、IL-6以及TNF-α定量檢測。檢測步驟按照試劑盒說明書程序操作，試劑盒均購自博士德生物科技有限公司。

1．2．3 流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞亞群：2組患兒于治療第1、14天清晨空腹時采集2 mL靜脈血標(biāo)本，肝素鈉抗凝處理，分別取100 μL加入適當(dāng)比例相應(yīng)抗體混勻。避光孵育半小時后加入紅細(xì)胞裂解液，半小時反應(yīng)后立即檢測，采用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)對全血標(biāo)本中CD3+T細(xì)胞,CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞以及NK細(xì)胞進(jìn)行檢測，并測定CD3+T淋巴細(xì)胞計數(shù)，NK細(xì)胞相對活性，外周血CD4+/CD8+細(xì)胞比值。

1．2．4 病毒性腹瀉檢測：腹瀉患兒入院24 h內(nèi)收集標(biāo)本，或腹瀉3 d內(nèi)的糞便。標(biāo)本采集后立即予-20 ℃冰箱保存。所有標(biāo)本由國家疾控中心病毒所腹瀉室進(jìn)行統(tǒng)一檢測，檢測內(nèi)容包括HRV、HuCV、EAdV、HAstV抗原檢測。HRV使用酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行抗原檢測，HuCV、EAdV、HAstV直接使用PCR的方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2．1 2組患兒血清炎癥因子的表達(dá)2組患兒發(fā)病初期體內(nèi)細(xì)胞因子水平均明顯升高。與治療第1天相比，第14天所有患兒血清IL-2、IL-6及TNF-α均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；第14天單純病毒感染組較合并病毒性腦炎患兒IL-2、IL-6及TNF-α水平降低更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)。

2．2 2組細(xì)胞免疫功能的表達(dá)2組患兒發(fā)病初期細(xì)胞免疫表達(dá)均下調(diào)。與治療第1天相比，第14天2組CD3+T細(xì)胞、NK細(xì)胞相對活性及外周血CD4+/CD8+比值較治療前顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；第14天單純病毒感染組較合并病毒性腦炎組CD3+T細(xì)胞、NK細(xì)胞相對活性及外周血CD4+/CD8+比值顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

3 討論

兒童病毒性腹瀉病病原主要為：輪狀病毒、人類星狀病毒、人杯狀病毒、腸道腺病毒[6、7]。腸道病毒感染患兒早期產(chǎn)生的大量IL-2、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子破壞毛細(xì)血管內(nèi)皮，導(dǎo)致組織損傷[8]，微血管循環(huán)障礙及微血管壁通透性增加，誘發(fā)全身組織炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子在病毒性腦炎患兒多個病程階段進(jìn)行調(diào)節(jié)[9]。Th1細(xì)胞活化后產(chǎn)生IL-2，IL-2刺激巨噬細(xì)胞分化、促進(jìn)NK細(xì)胞增殖及CTL細(xì)胞成熟分化，介導(dǎo)細(xì)胞免疫發(fā)生；增加IL-2R在T細(xì)胞表面的表達(dá)，刺激其他細(xì)胞因子的分泌。正常功能的IL-2能增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的活性，調(diào)節(jié)感染的免疫應(yīng)答及免疫病理的過程，從而抑制病毒感染及其它相關(guān)病理變化。但是，若IL-2的產(chǎn)生或表達(dá)異?？蓪?dǎo)致疾病的發(fā)生。IL-6因子介導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，促進(jìn)B細(xì)胞分化，活化T細(xì)胞增殖，促進(jìn)T細(xì)胞分化為CTL細(xì)胞；可降低TNF-α活性和誘導(dǎo)急性期蛋白的產(chǎn)生，起到抗炎作用，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫及細(xì)胞功能，促進(jìn)B細(xì)胞分泌表達(dá)特異性抗體[10]，抗體清除抗原，降低炎癥反應(yīng)，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗損傷防御起到重要作用[11-12]。IL-6亦可誘導(dǎo)機(jī)體免疫細(xì)胞抗病毒，與巨噬-粒細(xì)胞集落刺激因子共同作用使免疫細(xì)胞增殖分化，誘導(dǎo)T細(xì)胞的祖細(xì)胞生成CTL細(xì)胞，進(jìn)一步介導(dǎo)組織免疫損傷；IL-6作為內(nèi)源性致熱源參與炎癥反應(yīng)，使炎癥反應(yīng)增強(qiáng)并持續(xù)。既往研究發(fā)現(xiàn)，IL-2、IL-6參與機(jī)體局部的免疫應(yīng)答反應(yīng)，其介導(dǎo)免疫失衡過程中具有關(guān)鍵的作用[13-14]。TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子，由單核-巨噬細(xì)胞分泌合成，具有多重生物學(xué)行為，主要來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染時，病原體透過血腦屏障侵犯腦組織時，病毒直接刺激和炎性因子的作用下導(dǎo)致TNF-α高水平表達(dá)[15-16]，病菌感染時介導(dǎo)炎癥傳遞，引起宿主組織細(xì)胞嚴(yán)重的發(fā)熱、休克等病理損害，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)展。腦組織在病毒直接刺激和炎性因子的作用下，對腦組織細(xì)胞的抑制或殺傷越明顯[17-18]。

表1 2組血清炎癥因子的表達(dá)Table 1 Expression of serum inflammatory factors in 2

表2 2組細(xì)胞免疫的表達(dá)Table 2 Expression of cellular immunity in 2

研究揭示炎癥因子的檢測有助于病毒性腦炎的診斷[19-20]，合并癲癇患兒炎癥反應(yīng)更明顯[21]。本研究2組患兒發(fā)病早期IL-2、IL-6、TNF-α水平均明顯增高，腸道病毒合并病毒性腦炎患兒細(xì)胞因子水平明顯高于單純腸道病毒感染患兒，表明病毒性腦炎患兒體內(nèi)存在炎癥過度反應(yīng)；經(jīng)治療后上述指標(biāo)明顯下降，但合并腦炎患兒細(xì)胞因子水平在第14天仍高于單純腸道病毒感染組。推測病毒性腦炎患兒腦組織細(xì)胞損傷后刺激炎性因子，激活細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)，從而加重腦炎患兒病情。因此，細(xì)胞因子變化可以預(yù)測病毒性腦炎患兒嚴(yán)重程度。

機(jī)體免疫系統(tǒng)主要由細(xì)胞免疫、體液免疫及固有免疫構(gòu)成。其中T淋巴細(xì)胞是清除病毒感染重要的免疫細(xì)胞，體內(nèi)的細(xì)胞免疫功能所處的狀態(tài)由它的數(shù)量及功能反映。目前主要由流式細(xì)胞儀測定T細(xì)胞亞群，是判定細(xì)胞免疫功能高低的主要方法之一。NK細(xì)胞作為固有免疫的關(guān)鍵細(xì)胞，是機(jī)體抵抗外來病毒感染的首要屏障，可直接識別并殺傷病毒感染，還可分泌IFN、TNF等細(xì)胞因子干擾病毒復(fù)制，吞噬細(xì)胞活化增殖，提高機(jī)體抵抗病毒感染的防御能力，在阻止腸道病毒感染機(jī)體的過程中起到重要作用。機(jī)體感染腸道病毒后，激活免疫細(xì)胞，免疫系統(tǒng)活化并啟動應(yīng)答[22]，病毒感染神經(jīng)系統(tǒng)時破壞血腦屏障功能，侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活化T淋巴細(xì)胞與神經(jīng)組織細(xì)胞共同釋放大量IL-2、IL-6、TNF-α炎性因子，從而介導(dǎo)腦組織產(chǎn)生炎癥損傷[23-24]。 因此，病毒感染直接導(dǎo)致機(jī)體免疫功能損傷、紊亂，激活T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥免疫損傷[25]。根據(jù)T淋巴細(xì)胞在免疫應(yīng)答中不同作用分為多個亞群，可激活巨噬細(xì)胞增殖、促進(jìn)B淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞及CD8+淋巴細(xì)胞分化成熟，產(chǎn)生分化因子和生長因子[26]。機(jī)體正常的 免疫應(yīng)答由CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)量、NK細(xì)胞的活性，及不同細(xì)胞亞群間相互信息的傳遞所決定[27]。CD4+、CD8+T細(xì)胞相互制約產(chǎn)生適度的免疫應(yīng)答，既能清除病原體又不損傷自身組織，處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，機(jī)體免疫抑制時CD4+/CD8+比值的降低，當(dāng)比值的升高時可上調(diào)機(jī)體細(xì)胞免疫功能，機(jī)體免疫功能的穩(wěn)定有賴于其比值動態(tài)平衡。NK細(xì)胞是機(jī)體重要的抗感染及抗腫瘤免疫防御細(xì)胞，NK細(xì)胞活性增加及功能恢復(fù)利于機(jī)體清除感染，保護(hù)組織臟器功能，病毒性腦炎患兒NK細(xì)胞明顯受損[28]，NK細(xì)胞功能減低或者功能缺陷會發(fā)生嚴(yán)重的腸道病毒的感染，機(jī)體發(fā)生細(xì)胞免疫紊亂，產(chǎn)生過量的細(xì)胞因子，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)范圍，侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)時，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管通透性增加，繼發(fā)產(chǎn)生多種神經(jīng)毒物質(zhì)，直接或間接加重腦組織水腫[29]，輕重癥病毒性腦炎均存在細(xì)胞免疫紊亂，臨床癥狀與細(xì)胞紊亂呈正相關(guān)，與臨床預(yù)后正相關(guān)。同時，病毒性腦炎患兒伴隨免疫力低下，臨床發(fā)展結(jié)局與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)[30]。因此，CD3+T細(xì)胞的表達(dá)，外周血CD4+/CD8+比值的平衡及NK細(xì)胞相對活性可反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)。

CD3+T細(xì)胞測定反映總T細(xì)胞計數(shù)，機(jī)體總體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。CD4+T細(xì)胞主要為輔助性Th細(xì)胞，在機(jī)體的免疫應(yīng)答過程中受到抗原刺激后，由不同的細(xì)胞因子介導(dǎo)分化成的不同亞群，包括Th1、Th2、Thl7細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)，Th1在機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答與遲發(fā)性超敏反應(yīng)起主導(dǎo)作用，并刺激B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白。而Th2可分泌IL-4、IL-5、IL-9等細(xì)胞因子，參與體內(nèi)體液免疫應(yīng)答，協(xié)同B細(xì)胞生成特異性IgE，發(fā)揮機(jī)體非吞噬功能的防御反應(yīng)。人體的正常免疫功能有賴于Thl與Th2間動態(tài)平衡[31-36]。CD8+T細(xì)胞活化后可參與病毒的清除過程，是清除病毒的重要效應(yīng)細(xì)胞。同時，機(jī)體細(xì)胞免疫系統(tǒng)的應(yīng)答調(diào)節(jié)與病毒性腦炎患兒預(yù)后有顯著相關(guān)性[37-40]。本研究2組患兒發(fā)病初CD3+T細(xì)胞、 NK細(xì)胞相對活性、CD4+/CD8+比值均低于正常值，提示腸道病毒感染患兒機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，細(xì)胞免疫功能的低下與紊亂。治療后較前升高，但腸道病毒感染合并腦炎患兒NK細(xì)胞相對活性、CD4+/CD8+比值顯著低于單純腸道病毒感染者，推測可能與腸道病毒感染合并病毒性腦炎患兒機(jī)體下調(diào)細(xì)胞免疫功能有關(guān)[41-42]，且感染程度嚴(yán)重的細(xì)胞免疫抑制更明顯，病毒進(jìn)入腦脊液加速神經(jīng)細(xì)胞損傷，從而揭示病情嚴(yán)重程度與免疫功能存在負(fù)相關(guān)，調(diào)節(jié)免疫利于病毒性腦炎的恢復(fù)[43-47]。

腸道病毒感染患兒存在免疫功能紊亂、細(xì)胞因子激活狀態(tài)，且與病情嚴(yán)重程度存在相關(guān)性，患兒臨床癥狀越重，細(xì)胞紊亂越嚴(yán)重，患兒預(yù)后也越差。早期全面了解機(jī)體免疫功能，為病毒感染治療提供了重要線索，從而降低并發(fā)癥的發(fā)生率。