巨噬細胞CT靶向定量對斑塊易損性風險預測的研究*

李 江 秦 健 閆呈新 趙 雷 朱建忠

(泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院 醫(yī)學影像科，山東 泰安 271000)

巨噬細胞能夠吞噬血管內皮下脂質成分，這是粥樣硬化性斑塊內泡沫細胞的重要來源[1]。此外巨噬細胞能夠合成并釋放多種炎性因子，進而擴大炎癥級聯(lián)反應，最終導致粥樣硬化性斑塊的破裂[2]。本研究旨在通過特異性靶向CT對比劑，對斑塊內巨噬細胞進行分子影像學量化，進而探討量化指標與斑塊穩(wěn)定性的相關關系及對斑塊破裂風險的預測價值。

1 材料與方法

1.1 制備AuNPs、Au-rHDL復合物

通過兩相法和均相法，提取氯金酸溶液中的金離子，制得穩(wěn)定的納米金粒子(gold nanoparticles，AuNPs)；進一步合成以AuNPs為核心、以重組高密度脂蛋白(recombinant HDL，rHDL)為外殼的膠粒。即Au-rHDL。

1.2 粥樣硬化動物模型的建立

選取雄性新西蘭大白兔10只(3月齡，2.0～2.5 kg)。所有實驗兔均適應性常規(guī)飼料喂養(yǎng)1周，抽取空腹12 h后靜脈取血，測定TC、TG、HDL、LDL水平。所有實驗兔均行高脂飼料聯(lián)合免疫損傷的方法喂養(yǎng)，喂養(yǎng)過程中有2只實驗兔不能耐受并予以突剔除。喂養(yǎng)滿30周時，所有實驗動物空腹12h后再次測定TC、TG、HDL、LDL水平。

1.3 圖像采集及量化數(shù)據(jù)提取

選用Philips 256層螺旋CT進行掃描。掃描前先進行腹腔注射麻醉，行常規(guī)CT平掃；而后高壓注射器經(jīng)耳緣靜脈向實驗動物體內注入適量Au-rHDL和生理鹽水(注射速率：1.0 ml/s)，獲取延遲24 h后CT圖像。掃描參數(shù)：管電壓75 kV，管電流90 mA，球管旋轉時間0.5 s，矩陣512×512。對原始圖像進行拉直多平面重組(straightened multiplanar reformatted，SMPR)。在重組后圖像中利用基于感興趣區(qū)(region of interest，ROI)選取工具，計算平掃序列的選定橫斷面血管面積(vessel area，VA)及相應層面延遲24 h后對比劑存留區(qū)域面積(contrast agent retention area，CARA)，并計算兩者比值(CARA/VA)。測量由兩名高年資醫(yī)師雙盲法完成，取兩次測量(間隔1個月)的平均值。

1.4 病理免疫組化分析

所有掃描完成后，處死實驗動物(過量麻醉)并獲取腹主動脈標本，經(jīng)固定保存、包埋冰凍后，沿血管縱軸進行連續(xù)切片，獲取厚度10 μm，間隔1 mm的橫斷面切片。經(jīng)MAC-3免疫組化染色后，判斷AuNPs聚集區(qū)是否與巨噬細胞分布一致。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 實驗動脈建模前后血脂指標對比

與建模前對比，動物模型血脂指標產生明顯變化，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 病理免疫組化分析

腹主動脈粥樣斑塊內，巨噬細胞聚集區(qū)域與對比劑存留區(qū)域相一致。

表1 實驗兔建模前后血脂指標對比

2.3 圖像后處理量化指標的分析

以斑塊CT值為斑塊易損性判斷依據(jù)[3]：CT值<50Hu的斑塊定義為易損性斑塊，且CT值越低、易損性越高；CT值≥50Hu的斑塊定義為穩(wěn)定性斑塊。與穩(wěn)定斑塊組相比，易損斑塊組CARA/VA值相對較大，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2、圖1；且CARA/VA值與斑塊CT值具有較高的相關關系(r=0.765，P<0.05)。ROC曲線研究發(fā)現(xiàn)，CARA/VA值曲線下面積(area under the curve，AUC)明顯大于CT值，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)見表3、圖2。

表2 組間CARA/VA值與CT值的比較

注：VA=3.14mm2，CARA=1.19mm2，CARA/VA=0.38。

圖1 注入對比劑延遲24h后所得血管重組斷面圖像

表3 ROC曲線下面積分析

a：在非參數(shù)假設下

注：A線表示CARA/VA值，B線表示CT值。

圖2 易損斑塊組中CARA/VA值與CT值的ROC曲線圖

3 討 論

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)引發(fā)的心腦血管疾病，是長期以來威脅人類健康的多發(fā)性疾病[4]。不同患者之間 AS 病理結構和臨床表現(xiàn)各有差異：①以斑塊導致動脈管腔狹窄為主要病因。隨著斑塊的增大，動脈管腔狹窄導致遠端供血不足及組織缺氧，從而產生臨床癥狀(如穩(wěn)定性心絞痛)；②以易損斑塊破裂導致急性血栓形成為主要病因。易損斑塊破損常導致供血區(qū)組織急性缺血壞死(如急性冠脈綜合征和腦梗塞)[5]。長期以來，臨床使用Framinghanm 評分評估患者心血管事件危險度，但研究表明2/3急性冠脈綜合征患者僅屬于中度危險人群[6]。雖然高敏C-反應蛋白(hsC-RP)、脂蛋白相關的磷脂酶A2、核轉錄因子NF-κB、纖維蛋白原等血清學標志物可以預測人群心腦血管急性事件的危險性，但距離易損患者“個性化”預警尚存在差距。

尸檢研究表明破裂的粥樣硬化斑塊中含有大量的巨噬細胞，結果提示巨噬細胞在斑塊并發(fā)癥中起到關鍵作用[7]。同時，大多數(shù)斑塊薄纖維帽可通過自我修復而長期處于靜止狀態(tài)[8]，而纖維帽內巨噬細胞的浸潤可能是導致纖維帽破裂的關鍵因素[9]。因此，巨噬細胞在斑塊發(fā)展過程中對斑塊形態(tài)、體積、成份變化及轉歸有著重要作用。利用影像學技術對局部動脈粥樣硬化斑塊內巨噬細胞的早期發(fā)現(xiàn)、量化評估，對預防心腦血管疾病具有非常重要的臨床意義。

本研究通過合成以AuNPs為核心、以rHDL為包裹的具有生物學活性及靶向性的特異性對比劑，利用CT成像技術及重組技術，實現(xiàn)了對粥樣硬化性斑塊內巨噬細胞影像學量化和空間定位。通過與病理免疫組化切片結果相對照，兩者結果相一致。課題組進一步研究發(fā)現(xiàn)，由于不同層面斑塊面積存在差異，單純以CARA作為指標進行分析誤差較大，因此本研究創(chuàng)新性提出CARA/VA值這一量化指標，其代表截面內巨噬細胞面積與管腔面積的比值。分組研究證實穩(wěn)定斑塊組的CARA/VA值明顯低于易損斑塊組，即表明斑塊內巨噬細胞含量越大易損風險性越高。這與Ruddy等[10]的研究結果相一致。同時CARA/VA值與斑塊的CT值具有較高的相關性(r=0.765，P<0.05)，進一步研究發(fā)現(xiàn)CARA/VA值與斑塊穩(wěn)定性密切相關。且CARA/VA值判別斑塊易損性的ROC曲線下面積(AUC=0.859)明顯大于CT值(AUC=0.687)，表明CARA/VA值在斑塊破裂風險預測方面較CT值具有更為顯著的敏感性及特異性。

大量證據(jù)表明，AS是一個以局部突出表現(xiàn)為主，以動脈粥樣硬化斑塊炎癥為核心的全身系統(tǒng)性疾病[11]。早期局部微環(huán)境的變化、細胞成分的改變及比例的失調明顯早于醫(yī)學影像學的陽性發(fā)現(xiàn)。本研究通過特異性靶向對比劑，以活體內動脈粥樣硬化斑塊為模型，以巨噬細胞為分子成像目標，實現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊內巨噬細胞成份的量化、空間定位，成功建立了“結構—功能”影像學特征預測斑塊病理結構的關聯(lián)模型，為動脈粥樣硬化斑塊疾病早期預警提供理論基礎。