現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)在感染性疾病領(lǐng)域的應(yīng)用*

楊 洋 肖 盟 楊文航 張 戈 張京家 段思蒙 康 巍 王 瞳 徐英春*

實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)在感染性疾病的預(yù)防、診斷和治療過(guò)程中均起著舉足輕重的作用，現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)(pointof-care testing，POCT)作為一個(gè)新興的檢驗(yàn)技術(shù)，受到越來(lái)越多的關(guān)注。美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)(College of American Pathology，CAP)定義POCT為“用于在患者所在地開(kāi)展、不需要永久性固定場(chǎng)所、可在臨床實(shí)驗(yàn)室區(qū)域以外進(jìn)行的檢測(cè)項(xiàng)目”[1]。通過(guò)闡述POCT的醫(yī)學(xué)價(jià)值、技術(shù)特點(diǎn)以及應(yīng)用現(xiàn)狀，綜述POCT在感染性疾病領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 感染性疾病POCT的診斷意義

POCT具備實(shí)驗(yàn)室儀器小型化、操作方法簡(jiǎn)單化和結(jié)果報(bào)告即時(shí)化的特點(diǎn)，在感染性疾病診斷方面具有諸多優(yōu)勢(shì)[2-3]。

1.1 為重癥感染針對(duì)性治療提供依據(jù)

由于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室診斷方法耗時(shí)較長(zhǎng)，目前醫(yī)院收治重癥患者后，主要根據(jù)患者臨床癥狀，聯(lián)合一種或數(shù)種廣譜抗生素進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性治療，而盡早確定感染病原種類，可指導(dǎo)臨床開(kāi)展更有效的目標(biāo)性治療。同時(shí)，一些分子POCT方法可檢測(cè)部分病原的常見(jiàn)耐藥機(jī)制，避免臨床采用錯(cuò)誤的治療方案。

1.2 提高感染性疾病診療效率

在社區(qū)醫(yī)院中，常見(jiàn)的由A群鏈球菌引起的咽炎、衣原體感染乃至淋球菌感染，利用POCT方法可快速甄別此類患者并指導(dǎo)正確治療，避免門診患者隨訪失聯(lián)、或加重患者及臨床進(jìn)一步診療的工作量與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

1.3 協(xié)助醫(yī)療機(jī)構(gòu)院內(nèi)感染控制

醫(yī)院的發(fā)展面臨成本效益的挑戰(zhàn)，而院內(nèi)感染控制是醫(yī)療機(jī)構(gòu)成本控制中極為重要的環(huán)節(jié)。POCT技術(shù)已被應(yīng)用于院內(nèi)感染監(jiān)測(cè)，可協(xié)助臨床及相關(guān)管理部門快速識(shí)別潛在傳染源，以采取有效措施切斷病原傳播途徑。

2 感染性疾病POCT的診斷方法與平臺(tái)

2.1 POCT方法

Peeling等[4]的研究中，將POCT的價(jià)格低廉(affordable)、敏感(sensitive)、特異(specific)、用戶友好(user-friendly)、快速(rapid)、不需設(shè)備(equipment-free)和便于應(yīng)用(deliverable)縮寫為“ASSURED”，提出臨床對(duì)POCT方法學(xué)的期望。

最早應(yīng)用于感染性疾病的POCT方法是酶免疫法(enzyme immunoassay，EIA)中的側(cè)流免疫層析法，應(yīng)用領(lǐng)域涵蓋細(xì)菌、病毒、真菌以及寄生蟲(chóng)診斷。該方法的檢測(cè)試劑條上攜有結(jié)合了信號(hào)標(biāo)記(如金標(biāo)或熒光標(biāo)記)的檢測(cè)抗體，可與臨床樣本中的特定病原抗原相結(jié)合，之后抗原-抗體復(fù)合物在裂解液或毛細(xì)管作用下在固相底物上前移并產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。

酶免疫夾心法是基于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法改良而來(lái)，所檢測(cè)抗原需≥2個(gè)不同的抗原表位，分別用于結(jié)合捕獲與信號(hào)抗體形成三明治結(jié)構(gòu)。該方法被廣泛應(yīng)用于A群鏈球菌、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)和肝炎病毒的檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間5～30 min，使用肉眼或小型讀取儀對(duì)顯色或熒光信號(hào)進(jìn)行結(jié)果讀取與判定[5-6]。由于其成本低廉且不依賴專業(yè)人員操作，快速EIA檢測(cè)方法在臨床實(shí)驗(yàn)室使用廣泛，但與其他更為復(fù)雜、精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法相比，POCT的EIA方法在特異性和敏感性方面有所差距，同時(shí)，操作者肉眼讀取可能造成假陰性或假陽(yáng)性[7-8]。

為彌補(bǔ)EIA方法存在的缺陷，核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(nucleic acid amplification tests，NAAT)方法開(kāi)始應(yīng)用于POCT領(lǐng)域[9-10]。由于使用病原特異性的核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)或脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)探針，使用NAAT技術(shù)進(jìn)行疾病檢測(cè)與診斷的可靠性更高。

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中，分子檢測(cè)方法已成為許多種類感染性疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但傳統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法操作過(guò)程復(fù)雜且成本較高，需使用較大型的核酸擴(kuò)增與檢測(cè)設(shè)備，不能滿足POCT需求。新近NAAT技術(shù)的發(fā)展，克服了既往分子檢測(cè)相關(guān)使用的局限性，其中最具代表性的是恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(isothermal amplification)的出現(xiàn)與應(yīng)用。如環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)借助新型聚合酶以及反應(yīng)體系設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)60～65 ℃恒溫條件下待測(cè)物的擴(kuò)增，極大降低了檢測(cè)對(duì)儀器的依賴性，降低了成本和操作復(fù)雜性，并已應(yīng)用于結(jié)核、瘧疾等重大傳染性疾病的檢測(cè)[1，9-10]。

2.2 POCT平臺(tái)

目前，POCT方法的檢測(cè)平臺(tái)向2個(gè)方向發(fā)展：①傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室大型檢測(cè)設(shè)備的小型化，同時(shí)著重加強(qiáng)平臺(tái)的自動(dòng)化設(shè)計(jì)，降低對(duì)人員操作水平的要求；②單次使用的手持型設(shè)備得益于微制造技術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)步，此類設(shè)備目前已將復(fù)雜的樣本處理、試劑儲(chǔ)存、檢測(cè)反應(yīng)及結(jié)果讀取等模塊集中于很小的平臺(tái)空間中。隨著科學(xué)技術(shù)尤其是信息與網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展，目前有更多新型的POCT平臺(tái)，如基于手機(jī)的瘧疾涂片閱片系統(tǒng)[11]正不斷投入研發(fā)與應(yīng)用。

3 POCT在感染性疾病中的應(yīng)用

3.1 化膿性鏈球菌檢測(cè)

美國(guó)感染性疾病學(xué)會(huì)的數(shù)據(jù)顯示，每年因咽炎就診的患者達(dá)1500萬(wàn)人次，而化膿性鏈球菌是引起咽炎重要的病原之一，在兒童患者中占比可達(dá)30%[12]。目前針對(duì)化膿性鏈球菌的POCT檢測(cè)方法有很多，其中最常用的仍為側(cè)流免疫層析法，總體靈敏度可達(dá)76%～83%[13-14]。多項(xiàng)研究表明，使用POCT方法快速檢測(cè)化膿性鏈球菌可有效降低咽峽炎以及下呼吸道感染中過(guò)度處方的情況[15-16]。

3.2 隱球菌抗原檢測(cè)

通過(guò)乳膠凝集試驗(yàn)或側(cè)流免疫層析法檢測(cè)隱球菌莢膜多糖抗原(cryptococcal capsular polysaccharide antigen，CrAg)是國(guó)際上廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法。目前大部分CrAg檢測(cè)仍在臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，但世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)建議，由于該方法快速、成本低廉、操作簡(jiǎn)便及對(duì)操作人員要求低，可作為POCT進(jìn)行開(kāi)展[10，17]。近期一項(xiàng)研究表明，在資源有限地區(qū)，使用指血進(jìn)行CrAg的POCT技術(shù)可有效進(jìn)行患者分層[18]。WHO建議，在隱球菌流行區(qū)域，CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)＜100 細(xì)胞/ml的HIV患者在抗病毒藥物使用之前應(yīng)進(jìn)行CrAg篩查[17]。

3.3 HIV檢測(cè)

HIV快速檢測(cè)是POCT在感染性疾病領(lǐng)域應(yīng)用時(shí)間最長(zhǎng)且最為成功的案例之一。目前，市場(chǎng)上已有大量基于側(cè)流免疫層析法的HIV快速檢測(cè)產(chǎn)品，可用于指血全血、靜脈全血、血漿或口腔標(biāo)本的檢測(cè)，且第四代HIV的POCT產(chǎn)品已獲得批準(zhǔn)，可同時(shí)進(jìn)行HIV抗原與抗體檢測(cè)。有研究表明，第四代HIV快速檢測(cè)產(chǎn)品與參考實(shí)驗(yàn)室方法相比，靈敏度可達(dá)91%～100%[19-20]。此外，基于NAAT的HIV-1和HIV-2檢測(cè)方法也已問(wèn)世，僅需25 μl全血或血漿樣本即可完成POCT檢測(cè)[21]。HIV快速檢測(cè)產(chǎn)品的普及應(yīng)用，可協(xié)助患者確診以盡早的抗病毒治療，同時(shí)從公共衛(wèi)生層面可通過(guò)有效的指向性干預(yù)減少HIV傳播的發(fā)生[22]。

3.4 性傳播疾病檢測(cè)

常見(jiàn)引起性傳播疾病(sexually transmitted diseases，STD)的病原包括沙眼衣原體、人乳頭瘤病毒、淋病奈瑟菌、陰道毛滴蟲(chóng)、梅毒螺旋體及單純皰疹病毒等。STD出現(xiàn)長(zhǎng)期癥狀之前，會(huì)有一段無(wú)癥狀期，因此，需要可靠的篩查方法。在較為貧窮的國(guó)家及地區(qū)，由于缺乏醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)的支撐，僅憑公共衛(wèi)生干預(yù)很難在降低STD發(fā)生率方面取得顯著成果，而POCT方法的應(yīng)用恰恰可以改善這一狀況[23]。

目前可用于STD檢測(cè)的POCT試劑種類與品牌眾多，其中大部分仍基于側(cè)流免疫層析原理，然而使用該類技術(shù)獨(dú)立進(jìn)行STD診斷的效能仍有待提高。近期一項(xiàng)針對(duì)淋病奈瑟菌與陰道毛滴蟲(chóng)側(cè)流免疫層析類POCT檢測(cè)方法的報(bào)道中，不同研究得出的方法學(xué)靈敏度在12.5%～100%之間，特異度在38%～98%之間，差異較大；NAAT方法在一定程度上提高檢測(cè)性能，如Cepheid公司GeneXpert CTNG試劑盒是一種基于多重PCR的沙眼衣原體與淋病奈瑟菌快速檢測(cè)方法，特異度和靈敏度均達(dá)到95%以上[24]。然而，2017年發(fā)表的一項(xiàng)臨床研究指出，即使該技術(shù)可以很快完成檢測(cè)，但仍有78%以上的患者在獲得檢測(cè)報(bào)告前已經(jīng)離院[25]。因此，POCT在STD疾病檢測(cè)領(lǐng)域中仍需進(jìn)一步優(yōu)化與發(fā)展。

3.5 流感檢測(cè)

快速流感檢測(cè)是POCT在臨床微生物領(lǐng)域另一種最為廣泛的應(yīng)用，包括美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)在內(nèi)的管理機(jī)構(gòu)與學(xué)術(shù)組織均推薦流感癥狀出現(xiàn)48 h內(nèi)開(kāi)始抗病毒治療，以降低病死率、縮短病程并降低病毒二次傳播的風(fēng)險(xiǎn)[26]。目前，EIA仍是最常用的流感POCT方法。在美國(guó)，超過(guò)60%的醫(yī)療機(jī)構(gòu)僅以EIA作為流感患者篩查手段[26]；然而不同研究表明，該方法的檢測(cè)靈敏度僅有30%～90%，因此極可能發(fā)生漏檢[5，27]。新型分子技術(shù)的引入在提高準(zhǔn)確度與保障檢測(cè)速度方面找到了平衡點(diǎn)，在美國(guó)已獲得POCT許可的分子檢測(cè)方法包括Roche Cobas Liat Influenza A/B試劑盒和Alere Influenza A/B試劑盒2種，均可由非實(shí)驗(yàn)室人員在急診或醫(yī)生診室中操作使用。

3.6 結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)

結(jié)核分枝桿菌作為全球重點(diǎn)關(guān)注的傳染性疾病之一，其感染的檢測(cè)仍極大程度地依賴于傳統(tǒng)微生物實(shí)驗(yàn)室的顯微鏡檢或培養(yǎng)方法；然而前者敏感性不佳、后者耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)。自20世紀(jì)90年代美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)首個(gè)NAAT方法應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)[28]以來(lái)，Roche及Seegene等大型診斷公司亦在美歐等地推出了結(jié)核分枝桿菌的分子診斷方法，有效提高了檢測(cè)敏感性，縮短了檢測(cè)時(shí)間[29-30]。

盡管市場(chǎng)需求巨大，目前唯一被批準(zhǔn)用于POCT的結(jié)核分枝桿菌分子診斷方法僅Cepheid GeneXpert MTB/RIF一種。Lessells等[31]研究表明，與將樣本送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分子檢測(cè)相比，使用GeneXpert MTB/RIF方法進(jìn)行POCT檢測(cè)，患者開(kāi)始正確抗結(jié)核治療的時(shí)間中位數(shù)可由7 d縮短到1 d，且效果顯著。

3.7 醫(yī)院感染控制

醫(yī)院感染控制主要關(guān)注的病原包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus a u r e u s，MRSA)感染、萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌(vancomycin-resistant enterococci，VRE)感染、碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌(carbapenemresistant enterobacteriaceae，CRE)感染和艱難梭菌(clostridium difficile，CD)感染等?？焖僬鐒e相關(guān)耐藥病原菌感染乃至定植的個(gè)體，進(jìn)而借助隔離、消毒及去定植等方法，可有效控制傳播源，避免耐藥菌在醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)播散[32]。目前，美國(guó)已有針對(duì)MRSA的POCT檢測(cè)方法被批準(zhǔn)。美國(guó)North Shore醫(yī)院數(shù)據(jù)表明，通過(guò)開(kāi)展快速M(fèi)RSA篩查，醫(yī)院獲得性MRSA的發(fā)生率降低了69%以上[33]。然而，Wu等[34]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)POCT對(duì)MRSA進(jìn)行廣泛篩查雖然可以有效縮短病原檢出時(shí)間，但對(duì)MRSA的實(shí)際發(fā)生率并無(wú)顯著影響。相關(guān)研究均指出，醫(yī)院感染控制是一項(xiàng)綜合性工程，除病原檢測(cè)以外，其他防控措施在控制耐藥發(fā)生率方面也極為重要。

CD是另一種在歐美受到極大關(guān)注的耐藥病原菌。傳統(tǒng)的臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)依賴于EIA技術(shù)檢測(cè)糞便標(biāo)本中的CD毒素，敏感性不足；而新型分子生物學(xué)方法針對(duì)其毒素基因進(jìn)行檢測(cè)，具有更好的特異性及敏感性[35]。但尚未有POCT方法在美國(guó)獲批。Goldenberg等[36]研究中，將Cepheid GeneXpert CDI進(jìn)行POCT科研應(yīng)用：在22個(gè)月的研究期間，CD檢測(cè)結(jié)果的回報(bào)時(shí)間中位數(shù)由需要送至臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的18 h降低到POCT的1.8 h，同時(shí)檢測(cè)一致率達(dá)到98%。Schechner等[37]研究表明，通過(guò)CD快速檢測(cè)后對(duì)患者進(jìn)行單間隔離，使CD感染的發(fā)病率在350張床位中由9.4例/d下降到8.5例/d，同時(shí)保證了科室運(yùn)行的成本效益。

醫(yī)院感染其他重要耐藥病原菌的感染控制受益于快速檢驗(yàn)檢測(cè)方法的應(yīng)用，但相關(guān)產(chǎn)品(絕大多數(shù)為分子診斷產(chǎn)品)仍處于研發(fā)或評(píng)估階段，尚未有獲得POCT批準(zhǔn)的項(xiàng)目。

4 展望

POCT技術(shù)的應(yīng)用，為實(shí)驗(yàn)室、臨床乃至社會(huì)帶來(lái)重大變化。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步，更多先進(jìn)的快速檢驗(yàn)技術(shù)，如針對(duì)感染癥候群的小型自動(dòng)化分子生物學(xué)快速檢測(cè)平臺(tái)，已準(zhǔn)備進(jìn)入POCT應(yīng)用階段。然而需要意識(shí)到，POCT檢測(cè)在質(zhì)量控制、應(yīng)用場(chǎng)所等方面仍存在諸多挑戰(zhàn)，未來(lái)仍需更多的科學(xué)研究以及衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)評(píng)價(jià)，支持POCT領(lǐng)域的持續(xù)性創(chuàng)新發(fā)展。