自體吞噬在肌萎縮側(cè)索硬化癥中的研究進(jìn)展

賈 旭，羅 果

(遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099)

肌萎縮側(cè)索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)又稱(chēng)漸凍癥，是一種累及神經(jīng)[1]、肌肉[2]、骨骼[3]、腸道[4]等多系統(tǒng)的漸進(jìn)性致命性疾病，其主要病理特征表現(xiàn)為在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和骨骼肌細(xì)胞中出現(xiàn)線(xiàn)粒體病變和錯(cuò)誤折疊蛋白的累積[2]。95%的病人通常會(huì)在發(fā)病5年之內(nèi)死亡，病程進(jìn)展迅速。ALS患者中多數(shù)為散發(fā)性(Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis，SALS)，10%～15%為家族性(Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis，F(xiàn)ALS)[5]。ALS是多因素多系統(tǒng)復(fù)雜的疾病，早期診斷困難，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括：氧化應(yīng)激、谷氨酸鹽興奮毒性、線(xiàn)粒體損傷、疾病相關(guān)蛋白聚集、軸突運(yùn)輸異常、RNA代謝異常等[6]。自體吞噬(Autophagy)是生物體內(nèi)清除功能異常的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、被氧化的脂類(lèi)等有害大分子物質(zhì)的重要途徑。研究表明自噬會(huì)從多方面影響ALS的發(fā)生和發(fā)展，通過(guò)調(diào)控自噬來(lái)清除錯(cuò)誤蛋白質(zhì)是ALS研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本文將對(duì)ALS相關(guān)的主要突變蛋白以及自噬在ALS中的作用和機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 與ALS相關(guān)的主要突變蛋白研究

與其他神經(jīng)退行性疾病類(lèi)似，ALS的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制是疾病相關(guān)蛋白質(zhì)在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及其周?chē)?xì)胞中異常表達(dá)，以及形成錯(cuò)位蛋白與其相互作用物的細(xì)胞質(zhì)聚集體，表明ALS疾病進(jìn)程中蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)失衡[7]。目前研究證實(shí)與發(fā)病相關(guān)的主要蛋白有下列幾種。

1.1 銅-鋅超氧化物歧化酶及其相關(guān)蛋白 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一種抗氧化酶，能催化O2轉(zhuǎn)化為 H2O2，維持細(xì)胞內(nèi)活性氧內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡。Rosen等[8]首次報(bào)道超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突變與FALS相關(guān)。迄今為止，超過(guò)100種SOD1基因的涉及5個(gè)全部外顯子的不同致病性突變已被鑒定，為大多數(shù)FALS的致病原因[9]。突變SOD1蛋白的錯(cuò)誤折疊和聚集與毒性機(jī)制緊密相關(guān)，其毒性可由與鋅的結(jié)合力下降、Cu/Zn SOD蛋白穩(wěn)定性下降引發(fā)，導(dǎo)致線(xiàn)粒體空泡化和膨脹，引發(fā)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的毒性反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)量的自由基，繼而經(jīng)過(guò)毒性機(jī)制誘導(dǎo)神經(jīng)變性[10-11]。對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞系NSC34和小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的原代培養(yǎng)物的功能研究顯示，SOD1突變p.E121G誘導(dǎo)了SOD1和泛素陽(yáng)性的聚集，以及降低細(xì)胞存活率[12]。因此，抑制突變SOD1蛋白導(dǎo)致的毒性反應(yīng)有望成為治療ALS的可行策略。

1.2 TAR DNA 結(jié)合蛋白-43( TDP-43) TDP-43蛋白被鑒定為泛素化神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物的主要成分，其沉積于額顳葉癡呆(FTD)的皮層神經(jīng)元和ALS中的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元[13]， 43kDa的DNA結(jié)合蛋白(TDP-43)作為交換反應(yīng)的異質(zhì)核核蛋白，是額顳葉變性(FTLD)和肌萎縮側(cè)索硬化/運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(ALS / MND)中的主要病理蛋白。在20%～50%的散發(fā)性阿爾茨海默病例中合并發(fā)現(xiàn)TDP-43異常[14]。

1.3 肉瘤中融合/脂肪肉瘤轉(zhuǎn)位蛋白( FUS/TLS) 肉瘤中融合蛋白(FUS)是一種豐富的核RNA結(jié)合蛋白，也稱(chēng)為脂肪肉瘤轉(zhuǎn)位蛋白(TLS)，F(xiàn)US影響多個(gè)RNA生物合成水平。FUS將RNA聚合酶II(RNA Pol II)直接結(jié)合并募集至DNA，并抑制或重定向多種轉(zhuǎn)錄活化因子的活性[15]。FUS的突變是ALS的原因之一[16]，占FALS的5%和SALS的1%[15]。

2 自體吞噬

2.1 自體吞噬的分類(lèi)及過(guò)程 細(xì)胞中蛋白質(zhì)降解途徑主要為：泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)和自噬-溶酶體途徑[7]，相比UPS，自噬是一種更廣泛的降解途徑。越來(lái)越多的證據(jù)證明自噬在個(gè)體的生存和疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演十分重要的角色。自噬根據(jù)發(fā)生過(guò)程分為3類(lèi)：大自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)。Macroautophagy即研究最廣泛的自噬; Microautophagy是指溶酶體主動(dòng)、直接吞噬胞漿成分的一種方式; CMA指一些分子伴侶如 hsp70，能幫助未折疊蛋白轉(zhuǎn)位入溶酶體而形成自噬。自噬的形成包括4個(gè)階段：自噬泡(phagophore)的發(fā)生、自噬體(autophagosome)的形成、自噬的運(yùn)輸融合(fusion)、自噬的降解(degradation)[7,17]，如圖1[18]所示。

圖1 自噬的過(guò)程[18]

2.2 自噬形成的分子機(jī)制 目前發(fā)現(xiàn)的自噬相關(guān)蛋白質(zhì)有30多種，自噬相關(guān)蛋白質(zhì)相互結(jié)合，形成自噬復(fù)合體。自噬受mTOR依賴(lài)性和非依賴(lài)性途徑調(diào)控[19]。mTOR 作為一個(gè)絲-蘇氨酸蛋白激酶，能夠感知細(xì)胞內(nèi)ATP、生長(zhǎng)因子、胰島素的水平，進(jìn)而感受細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和能量的變化，參與組成mTORC1 和mTORC2，并可以受上游多種不同信號(hào)通路的調(diào)控，如經(jīng)典的 PI3K、MAPK等通路，影響自噬的發(fā)生[20]。mTOR的活化和抑制主要受到TSC1/TSC2 的調(diào)控[21]。而mTOR非依賴(lài)性通路則主要包括 RAS-MAPK、Ca-AMPK、p53、PTEN以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等[22]。雷帕霉素(Rapamycin)作為mTORC依賴(lài)性調(diào)控劑能激活自體吞噬反應(yīng)，減少錯(cuò)誤蛋白的累積，并且減輕神經(jīng)退行性疾病的癥狀,例如帕金森病、阿爾茨海默病、霍奇金病[19,23-26]。

3 自噬在ALS疾病中的研究

3.1 自噬對(duì)ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的影響 在對(duì)ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中關(guān)于mTOR非依賴(lài)性調(diào)節(jié)劑的研究中，Zhang等[27]發(fā)現(xiàn)非依賴(lài)mTOR的自噬增強(qiáng)劑海藻糖減少了SOD1和SQSTM1 / p62的聚集，降低泛素化蛋白的積累，并改善SOD1G93A小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的自噬流，自噬保護(hù)了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元并延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活，改善ALS小鼠模型中的自噬通量缺陷，從而減緩疾病的發(fā)展。Barmada等[28]研究發(fā)現(xiàn)在ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元模型中，誘導(dǎo)自噬可直接改善TDP-43蛋白的聚集，減輕神經(jīng)變性。提示自噬在ALS疾病模型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的錯(cuò)誤蛋白清除方面發(fā)揮了積極作用。

另有研究表明，自噬在ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元模型中起到了加速疾病發(fā)展的反作用，Zhang等[29]研究顯示雷帕霉素誘導(dǎo)了自噬泡的進(jìn)一步積累，卻未能降低ALS小鼠中突變SOD1聚集的水平，加快了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失和病程發(fā)展。Bhattacharya等[30]的研究表明雷帕霉素對(duì)ALS的SOD1 H46R / H48Q小鼠模型的疾病發(fā)作和存活無(wú)益。Rudnick 等[31]通過(guò)對(duì)Atg7 cKO小鼠與SOD1G93A小鼠雜交模型研究發(fā)現(xiàn)抑制自噬加速了疾病早期運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞死亡和肌肉的萎縮，但是卻通過(guò)減少神經(jīng)膠質(zhì)炎癥延長(zhǎng)了雜交小鼠模型的壽命。另一種調(diào)節(jié)劑Rilmenidine強(qiáng)烈誘導(dǎo)體內(nèi)自噬，降低可溶性突變的SOD1水平，但加重了SOD1G93A小鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性和疾病發(fā)展[32]，并造成了線(xiàn)粒體的損傷[32-33]。雖然增加的自噬可能是細(xì)胞對(duì)自身?yè)p傷的調(diào)控反應(yīng)，以清除錯(cuò)誤蛋白和損傷的線(xiàn)粒體，但是失控的自噬可能會(huì)引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)蛋白質(zhì)或者細(xì)胞器的過(guò)度消耗，從而在 ALS 疾病進(jìn)程中影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和加速細(xì)胞死亡。

3.2 自噬對(duì)ALS骨骼肌的影響 與ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元模型中自噬的研究相似，自噬在ALS肌肉模型研究方面也存在“雙刃劍”的作用。Oliván S等[34]在SOD1G93A小鼠疾病模型中發(fā)現(xiàn)骨骼肌中存在自噬清除錯(cuò)誤蛋白，但并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的激活。Xiao等[35]發(fā)現(xiàn)SOD1G93A小鼠肌肉在疾病進(jìn)展中出現(xiàn)自噬流的顯著減少，骨骼肌細(xì)胞的保護(hù)性自噬途徑被抑制。Ching等[36]研究也發(fā)現(xiàn)自噬的增加損害了肌肉正常功能?，F(xiàn)有研究提示通過(guò)調(diào)節(jié)自噬可能改善ALS進(jìn)程中骨骼肌萎縮的狀況。

3.3 自噬對(duì)ALS骨骼系統(tǒng)的影響 ALS患者的骨折發(fā)生率很高，表明患者可能存在骨量缺失。骨骼肌和骨骼之間關(guān)系密切，在ALS進(jìn)程中嚴(yán)重的肌肉退化可能對(duì)骨功能產(chǎn)生重要影響，并且骨穩(wěn)態(tài)的失衡也可能在疾病進(jìn)程中促進(jìn)神經(jīng)肌肉退化[37]。Zhu 等[3]研究發(fā)現(xiàn)ALS的G93A突變小鼠模型與WT小鼠相比，G93A小鼠骨小梁和皮質(zhì)骨量顯著減少，且出現(xiàn)肌肉萎縮的G93A小鼠中破骨細(xì)胞的形成和骨吸收顯著增強(qiáng)，該研究首次證明ALS會(huì)導(dǎo)致骨重建異常。另有研究發(fā)現(xiàn)SOD1G93A突變蛋白在線(xiàn)粒體內(nèi)的累積直接導(dǎo)致培養(yǎng)的MLO-Y4骨細(xì)胞的線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)功能障礙[38]。自噬在骨骼系統(tǒng)中的研究表明自噬對(duì)于維持骨穩(wěn)態(tài)及成骨細(xì)胞礦化方面起到一定作用[39-40]，提示通過(guò)調(diào)控自噬清除骨細(xì)胞中累積的突變蛋白、改善骨細(xì)胞中的線(xiàn)粒體功能及骨穩(wěn)態(tài)可能會(huì)成為ALS治療的新途徑。

3.4 自噬對(duì)ALS腸道菌群的影響 哺乳動(dòng)物腸道含有大量微生物，這些微生物對(duì)維持腸上皮穩(wěn)態(tài)和健康至關(guān)重要。Wu 等[4]通過(guò)檢測(cè)SOD1G93A小鼠模型的腸道發(fā)現(xiàn)，腸道的緊密連接結(jié)構(gòu)受損并且通透性增加，炎性細(xì)胞因子水平升高，且腸道中宿主先天免疫反應(yīng)和維持腸道微生物中發(fā)揮關(guān)鍵作用的Paneth細(xì)胞數(shù)量增加，首次證明了腸穩(wěn)態(tài)失衡與ALS疾病進(jìn)展的關(guān)系。Zhang 等[41]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)丁酸鹽治療的G93A小鼠，其腸道微生物穩(wěn)態(tài)恢復(fù)，腸道完整性得到改善，小鼠生存期延長(zhǎng)，且在ALS腸上皮細(xì)胞模型中，丁酸鹽能使SOD1突變蛋白的聚集減少，減緩疾病進(jìn)程。自噬在先天免疫系統(tǒng)中對(duì)不同的腸道微生物起著重要作用[42]。丁酸鹽能夠促進(jìn)腸道的自噬，在肝癌[43]、結(jié)腸癌[44]等可促進(jìn)自噬從而抑制結(jié)腸、直腸癌細(xì)胞增殖，并導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡。目前自噬是否直接參與ALS腸道菌群調(diào)節(jié)的研究較少，其具體的關(guān)系和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 展望

自噬是一把“雙刃劍”，是細(xì)胞對(duì)自身?yè)p傷的調(diào)控反應(yīng)，以清除錯(cuò)誤蛋白和損傷的細(xì)胞器，但是過(guò)度的自噬，可能會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的過(guò)度消耗，從而在ALS疾病進(jìn)程中影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和加速細(xì)胞死亡[5]。進(jìn)一步深入研究自噬在ALS疾病各系統(tǒng)中的機(jī)制及在疾病發(fā)展各階段中的作用，將對(duì)ALS及其他神經(jīng)退行性疾病的治療提供更好的思路和依據(jù)。