細(xì)葉石仙桃乙醇提取物自由基清除活性研究

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(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.廣西南寧市第五十六中學(xué)，廣西 南寧 530001；3.廣西師范學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院，廣西 南寧 530001 .)

細(xì)葉石仙桃(Pholidota cantonensis Rolfe)是蘭科石仙桃屬植物，根狀莖匍匐，分枝，直徑2.5～3.5nm，密被鱗片狀鞘，通常相距1-3厘米生假鱗莖，節(jié)上疏生根；假鱗莖狹卵形至卵狀長(zhǎng)圓形，長(zhǎng)1～2cm，寬5～8nm，基部略收狹成幼嫩時(shí)為籜狀鱗片所包，頂端生2葉?；ㄆ?月，果期8-9月。產(chǎn)浙江、江西、福建、臺(tái)灣、湖南、廣東和廣西。生于林中或蔭蔽處的巖石上，海拔200～850m。《滇藥錄》：全草(假鱗莖)治瘡癤紅腫疼痛，火灼傷?！兑退幹尽啡葜喂钦?，關(guān)節(jié)脫位。人體新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量自由基，與動(dòng)脈硬化、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、肌肉萎縮和老年癡呆等多種疾病相關(guān)[1-3]。由于合成的抗氧化劑副作用多，近年來(lái)科研工作者致力于尋找來(lái)源于植物的天然抗氧化劑[4-5]。細(xì)葉石仙桃作為一種常用的草藥，其抗氧化方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)冷浸法得到細(xì)葉石仙桃乙醇提取物，采用DPPH和羥自由基體系，評(píng)估其對(duì)自由基清除能力。

1 材料與儀器

UV1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析電子科技有限公司)。細(xì)葉石仙桃藥材購(gòu)于廣西百色。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于百靈威試劑公司(北京)。所有試劑均為分析純。

2 方法

2.1 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物制備

稱取20 g細(xì)葉石仙桃粉末，加入200 mL乙醇(95%)，冷浸72 h。重復(fù)上述操作3次，合并提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到細(xì)葉石仙桃乙醇提取物。

2.2 總黃酮含量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液(l mg/mL)于l0 mL量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉0.4 mL，靜置6min，加入5%硝酸鋁0.4mL，靜置6min。加5%氫氧化鈉試液4.0 mL，用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻。靜置15min，在510nm處測(cè)定吸收度。以吸收度對(duì)溶液濃度進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，推出回歸方程。

2.2.2 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物總黃酮含量測(cè)定

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液換為固定濃度提取物溶液，同上操作測(cè)定吸光度，多次測(cè)量求平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的蘆丁當(dāng)量，總黃酮含量以每克干物質(zhì)的蘆丁當(dāng)量(mg)表示，并計(jì)算提取得率。

2.3 二苯基苦味肼基自由基(DPPH)體系[4]

取不同濃度細(xì)葉石仙桃乙醇提取物提取物溶液(0.2、0.5、0.8、1.2、1.5、1.8和2.0 mg/mL)加入8 mL DPPH(0.004%)溶液中。在最大波長(zhǎng)處(517 nm)測(cè)吸光度，直到平衡為止。清除率計(jì)算公式如下：S % = (1-A樣品)/ A空白 × 100%。其中，A空白為未加藥液的DPPH溶液的吸光度，A樣品為加入藥液的DPPH溶液的吸光度。

2.4 羥自由基體系

以蒸餾水將75 mmo1/L鄰二氮菲無(wú)水乙醉溶液稀釋至7.5 mmol/L，依次往50 mL比色管中加入1.0 mL濃度7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液，5 mL pH7.4 PBS，1.0 mL FeSO4溶液，一定量的抗氧劑溶液，1.0 mL H2O2應(yīng)用液，以蒸餾水補(bǔ)充體積至25 mL。37 ℃保溫反應(yīng)60 min，測(cè)A510。既加抗氧劑，又加H2O2的為加藥管;不加抗氧劑，只加H2O2的為損傷管;未損傷管兩者均不加。羥自由基清除率s=[A加藥-A損傷)]/[A未損傷-A損傷]×100%。若為負(fù)值，則表示此時(shí)表現(xiàn)促氧化性；若為正值，則表示此時(shí)表現(xiàn)抗氧化性。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

以吸收度對(duì)溶液濃度進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，推出回歸方程為：y=9.6778x+0.0167(R=0.9992)。根據(jù)線性方程得出細(xì)葉石仙桃乙醇提取物的總黃酮含量測(cè)定結(jié)果，其總黃酮含量為39.6 mg/g。細(xì)葉石仙桃乙醇提取物具有較高的總黃酮含量。

3.2 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

3.2.1 不同濃度提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖1為不同濃度細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力。藥液濃度為0.2 mg/mL時(shí)，提取物對(duì)DPPH自由基的清除率為24.8%。藥液濃度為0.5和0.8 mg/mL時(shí)，提取物對(duì)DPPH自由基的清除率分別為48.7%和61.5%，分別為0.2 mg/mL時(shí)清除率的1.96和2.48倍。藥液濃度為1.8和2.0時(shí)，提取物對(duì)DPPH自由基的清除率分別為81.6%和83.7%，分別為0.2 mg/mL時(shí)清除率的3.29和3.38倍，表明隨著藥液濃度增加，提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力迅速增大。

圖1 不同濃度細(xì)葉石仙桃乙醇提取物 對(duì)DPPH自由基的清除能力

3.2.2 不同時(shí)間提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖2 不同時(shí)間細(xì)葉石仙桃乙醇提取物 對(duì)DPPH自由基的清除能力(濃度=2.0 mg/mL)

圖2列出了不同時(shí)間細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除率。隨著反應(yīng)時(shí)間增加，細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力增大。將濃度為2.0 mg/mL的提取物加入DPPH自由基時(shí)測(cè)得DPPH自由基清除率為58.9%，10 min后測(cè)得清除率增大至1.27倍，為74.7%。從圖2可以看出，反應(yīng)時(shí)間20 min后，DPPH自由基清除率增加較為平緩，反應(yīng)時(shí)間為70 min時(shí)的清除率為20 min時(shí)清除率的1.07倍。

3.3 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)羥基自由基的清除能力

圖3表示的是細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)羥基自由基的清除能力。隨著濃度增加，細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)羥自由基的清除能力迅速增大。濃度為0.2 mg/mL時(shí)該提取物對(duì)羥自由基的清除率為19.7%，濃度為0.5和0.8 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率分別增加至1.30和2.09倍，分別為25.6%和41.2%。值得注意的是，濃度為2.0 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率達(dá)到了100%。

圖3 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物 對(duì)羥基自由基的清除能力

3.4 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH和羥基自由基的EC50值

細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的EC50值為0.52 mg/mL，對(duì)羥自由基的EC50值為0.98 mg/mL。EC50的數(shù)值越大，表明抗氧化劑對(duì)自由基的清除能力越強(qiáng)。細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH和羥基自由基較低的EC50值表明其對(duì)DPPH和羥基自由基具有良好的清除能力，這可能與其較高含量的黃酮類物質(zhì)有關(guān)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了細(xì)葉石仙桃乙醇提取物的總黃酮含量，并采用DPPH自由基體系和羥自由基體系來(lái)評(píng)估其自由基清除活性。結(jié)果表明，細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH自由基顯示出良好的清除效果，濃度為2.0 mg/mL時(shí)清除率為83.7%。同時(shí)，該提取物對(duì)羥自由基具有優(yōu)異的清除能力，清除率最高達(dá)到了100%。細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除率與藥液濃度呈正相關(guān)性，而該提取物對(duì)DPPH自由基清除率也與反應(yīng)時(shí)間有關(guān)。細(xì)葉石仙桃乙醇提取物具有優(yōu)異的自由基清除能力，有望作為天然的自由基清除劑應(yīng)用。