腎安沖劑對(duì)阿霉素腎病綜合征大鼠Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白的影響

符逢春 ，林 輝 ，劉 彬 ，毛以林 ，瞿曉林

（1.湖南中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，湖南 株洲 412012；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是由許多疾病引起的，以腎小球基底膜通透性增加而發(fā)生的一組臨床癥候群，主要表現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥、高度水腫、高脂血癥。隨著病情的發(fā)展，可導(dǎo)致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，逐漸發(fā)展為終末期腎衰竭。研究NS發(fā)病機(jī)制和干預(yù)比較理想的動(dòng)物是阿霉素腎病綜合征大鼠，同時(shí)也是探討藥物治療機(jī)制的很好的實(shí)驗(yàn)［1］。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過(guò)度積累是NS腎小球硬化的重要標(biāo)志，其中ECM的主要成分纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和Ⅳ型膠原（collagen typeⅣ，Ⅳ-C）的含量明顯增加，腎小球內(nèi)Ⅳ-C、FN的含量可直接反映腎小球硬化的程度［2］。本研究利用阿霉素腎病綜合征大鼠模型，采用免疫組化技術(shù)觀察腎安沖劑對(duì)該模型大鼠腎臟Ⅳ-C和FN表達(dá)的影響，為延緩腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的中醫(yī)藥治療提供客觀的實(shí)驗(yàn)及臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 Ⅳ-C、FN免疫組化檢測(cè)試劑盒和DAB顯色劑，由武漢博士德生物工程有限公司提供；潑尼松片由昆明制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；鹽酸阿霉素（多柔比星）由法瑪西亞普強(qiáng)有限公司生產(chǎn)；腎安沖劑由黨參、生黃芪、白術(shù)、山藥、芡實(shí)、升麻、柴胡、仙茅、淫羊藿、當(dāng)歸、丹參、鳳尾草、山楂、甘草組成，由湖南中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校附屬第一醫(yī)院藥劑科制作（8 g／包）。

1.2 動(dòng)物 SD雄性大鼠72只，體重（250±20）g，中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2014－0002，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法 SD雄性大鼠72只隨機(jī)分為造模組共60只和正常對(duì)照組12只。阿霉素腎病綜合征大鼠模型的制作：依據(jù)文獻(xiàn)［3］，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)，造模組分兩次注射鹽酸阿霉素，第一天用阿霉素5 mg／kg注射于SD大鼠尾靜脈內(nèi)，1周后再次注射阿霉素2 mg／kg于SD大鼠尾靜脈內(nèi)，正常組也尾靜脈注射相應(yīng)生理鹽水兩次。造模組大鼠再分為腎安沖劑大劑量組、中劑量組、小劑量組，模型組和潑尼松組，每組12只。各治療組從注射阿霉素2次后第2天起，每天早上8時(shí)一次性灌胃給藥，連續(xù)給藥8周。各組給藥劑量按人和大鼠體表面積換算法計(jì)算，腎安沖劑大劑量組、中劑量組和小劑量組分別灌服腎安沖劑 10.32 g／（kg·d）、5.16 g／（kg·d）、2.58 g／（kg·d）， 模型組灌服蒸餾水 2 mL／d，潑尼松組灌服潑尼松 6.45 mg／（kg·d），正常對(duì)照組灌服生理鹽水2 mL／d。

1.4 Ⅳ-C和FN的分布及檢測(cè) 采用免疫組化法。治療8周后處死大鼠，取腎臟石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，采用SABC法檢測(cè)腎組織中的Ⅳ-C和FN。10%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用枸櫞酸鹽（pH＝6.0）微波修復(fù)；2%BSA封閉20 min。加一抗（FN，1∶100；Ⅳ-C，1∶100）37℃ 1 h，PBS（pH 7.2～7.6）洗3次；加二抗生物素化山羊抗小鼠IgG37℃ 20 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗 3 次；加 SABC 復(fù)合物液孵育 20 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗 4 次；DAB 顯色，蘇木紅復(fù)染，每次染色均以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。顯微鏡下觀察并攝片，結(jié)果以細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)中出現(xiàn)明顯的棕黃色反應(yīng)為陽(yáng)性。

1.5 結(jié)果判定 采用雙盲進(jìn)行分析，每組切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)掃描進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)量每一視野的陽(yáng)性目標(biāo)染色區(qū)域的平均灰度，取其平均數(shù)作定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布以（）表示，多組樣本間比較用F檢驗(yàn)，組間比較用q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 6組Ⅳ-C和FN表達(dá)的平均灰度比較 見(jiàn)表1。用低倍顯微鏡和高倍顯微鏡下觀察切片，鏡下可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒沉著，顆粒染色顯著高于背景。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中腎安沖劑小劑量組、中劑量組、大劑量組，模型組，潑尼松組分別有 4、3、2、2、3只大鼠死亡，均是由灌胃而導(dǎo)致死亡。

表1 6組Ⅳ-C和FN表達(dá)的平均灰度比較（）

表1 6組Ⅳ-C和FN表達(dá)的平均灰度比較（）

注：與模型組比較，1）P＜0.01；與腎安沖劑大劑量組比較，2） P＜0.01。

FN 87.23±11.341）171.64±13.06 142.62±13.381）2）131.37±21.701）2）112.16±13.041）144.81±16.671）2）組別正常對(duì)照組模型組腎安沖劑小劑量組腎安沖劑中劑量組腎安沖劑大劑量組潑尼松組n 12 9 8 9 1 0 9Ⅳ-C 80.07±14.91）154.5±18.4 132.6±15.61）2）123.6±18.51）2）102.7±22.01）128.0±14.01）2）

與模型組比較，各治療組腎臟Ⅳ-C和FN表達(dá)均明顯降低，說(shuō)明腎安沖劑和潑尼松均有降低Ⅳ-C和FN表達(dá)的作用，而以腎安沖劑大劑量組療效最好。

2.2 Ⅳ-C表達(dá)的光鏡觀察 見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞極少，偶見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞的棕黃色顆粒，且染色較淺；模型組的陽(yáng)性表達(dá)以棕黃色顆粒較多，且陽(yáng)性細(xì)胞的棕黃色顆粒均較深，陽(yáng)性表達(dá)以腎小球基底膜及腎小球系膜區(qū)較強(qiáng)；各治療組均可在一定程度上減輕陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，腎安沖劑大劑量組的腎小球基底膜有少量細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，明顯比模型組少，陽(yáng)性細(xì)胞的棕黃色顆粒染色深淺均勻，優(yōu)于潑尼松組、腎安沖劑小劑量組和腎安沖劑中劑量組。

2.3 FN表達(dá)的光鏡觀察 見(jiàn)圖2。正常對(duì)照組的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞極少，偶見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞的棕黃色顆粒，且染色較淺；模型組的陽(yáng)性表達(dá)以棕黃色顆粒較多，且陽(yáng)性細(xì)胞的棕黃色顆粒均較深，于腎小球系膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及少量腎小管上皮胞漿均可見(jiàn)；各治療組均可在一定程度上減輕陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，腎安沖劑大劑量組有少量細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，明顯比模型組少，陽(yáng)性細(xì)胞的棕黃色顆粒染色深淺均勻，優(yōu)于潑尼松組、腎安沖劑小劑量組和腎安沖劑中劑量組。

圖1 各組腎臟Ⅳ-C表達(dá)比較（×400）

圖2 各組腎臟FN表達(dá)比較（×400）

3 討 論

腎病綜合征屬中醫(yī)學(xué)的水腫范疇，為本虛標(biāo)實(shí)證，其病機(jī)為虛、壅、漏，虛以脾腎氣陽(yáng)虧虛為主，壅主要是水濕和瘀血，漏則表現(xiàn)為大量蛋白尿。腎安沖劑據(jù)此研制而成，方用生黃芪、淫羊藿溫補(bǔ)脾腎，益氣溫陽(yáng)為君藥；仙茅助淫羊藿溫腎補(bǔ)陽(yáng)，白術(shù)、黨參助生黃芪益氣健脾，芡實(shí)、山藥補(bǔ)脾益腎，共為臣藥；丹參、當(dāng)歸、山楂活血化瘀為佐藥；柴胡、升麻升提清氣，鳳尾草引濕濁由下而出，甘草調(diào)和諸藥。前期的研究表明腎安沖劑可降低腎病綜合征患者的血脂、尿蛋白，升高血漿白蛋白，明顯改善腎功能，對(duì)腎病綜合征治療有效［4-5］。

Ⅳ-C是腎小球基底膜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的主要成分，在腎纖維化的進(jìn)展中，隨著腎臟疾病發(fā)展，細(xì)胞外基質(zhì)積聚增多跟Ⅳ-C的合成和分泌增多及降解減少有關(guān)，最終發(fā)展為腎小球硬化和間質(zhì)纖維化［6］。有研究顯示腎小球纖維化過(guò)程中Ⅳ-C合成增加［7］。FN可激活炎癥細(xì)胞，最終促使腎間質(zhì)的纖維化［8］。薛痕等［9］研究發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型腎間質(zhì)FN的表達(dá)增加，并隨時(shí)間遞增，而且與間質(zhì)相對(duì)面積成正相關(guān)。也有研究表明無(wú)論是免疫性還是非免疫性損傷引起的腎小球硬化過(guò)程中，F(xiàn)N的變化都發(fā)生較早且明顯［10］。

本研究表明腎安沖劑可降低阿霉素腎病綜合征大鼠腎組織Ⅳ-C和FN的表達(dá)，從而可延緩該模型大鼠進(jìn)展為腎纖維化，為中醫(yī)藥抗腎纖維化提供了客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。