一種仿生材料用于腦卒中缺血半影的造影增強(qiáng)研究

程筱，楊芳

（江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210009）

0 引言

在過(guò)去的20 年中，突發(fā)性腦卒中、由腦卒中引起的傷殘調(diào)整生命年（DALYs，disability-adjusted life-years）及腦卒中相關(guān)的死亡率在世界范圍內(nèi)仍體現(xiàn)為持續(xù)增長(zhǎng)[1]，這一形勢(shì)在發(fā)展中國(guó)家表現(xiàn)得更為嚴(yán)峻。數(shù)據(jù)顯示，截止2017 年，腦卒中已成為全球第三大致殘及致死原因，其中缺血性腦卒中占60%以上[1]。根據(jù)預(yù)期，在未來(lái)的相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)，腦卒中對(duì)發(fā)展中國(guó)家公共醫(yī)療事業(yè)造成的壓力將持續(xù)增長(zhǎng)[2]。而在有關(guān)急性缺血性腦卒中臨床治療的探究中，能否在治療時(shí)間窗內(nèi)有效搶救缺血半影，很大程度上決定了腦卒中發(fā)病后的臨床生存率，并因此長(zhǎng)期占據(jù)著此類(lèi)研究的焦點(diǎn)。

缺血半影（ischemic penumbra，IP），即局部缺血后受損但尚未死亡（又定義為生理電活動(dòng)停止但能保持跨膜離子平衡和結(jié)構(gòu)完整或保持能量代謝而血供受限[3]）的腦組織區(qū)域。自1977 年半影的概念提出后[4]，缺血半影先后接受了在電生理、腦血流及代謝缺血調(diào)節(jié)層面、介導(dǎo)半影細(xì)胞死亡的分子機(jī)制層面與臨床神經(jīng)成像器材方面的廣泛研究[5]，有關(guān)其治療性搶救的理論可能性，意味著急性缺血性腦卒中臨床診療更為光明的未來(lái)。簡(jiǎn)而言之，急性缺血性腦卒中病灶的中心區(qū)域通常由于嚴(yán)重供血障礙（或完全缺血）而引起腦細(xì)胞非程序性死亡，而側(cè)支循環(huán)的存在使得缺血半影區(qū)仍能保持一定程度的血流供應(yīng)。半影區(qū)域內(nèi)，神經(jīng)細(xì)胞功能受到抑制（部分伴有功能損傷），但在再灌注時(shí)間窗內(nèi)仍保持存活并處于生理可逆狀態(tài)，即恢復(fù)供血可重新整合代謝、維持系統(tǒng)神經(jīng)功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)。目前，應(yīng)用于腦卒中臨床診斷的技術(shù)中，僅正電子斷層發(fā)射掃描（PET）可識(shí)別供血受限但仍存在一定代謝水平的腦組織、磁共振成像（MRI）可實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血病灶區(qū)域受細(xì)胞毒性影響有限的區(qū)域的識(shí)別，即對(duì)缺血半影的診斷[6]。

PAMNs（Platelet membrane coated L-arginine and magnetic nanoparticles）是一種血小板膜仿生氣體前體藥物納米遞送系統(tǒng)[7]，其主要機(jī)制為利用血小板膜包被一氧化氮（NO）前體材料L-精氨酸與磁性納米粒子，使其在血管環(huán)境中能夠被血小板膜上的特異性粘附蛋白靶向至卒中病灶，并藉由內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮合成酶（eNOS）的作用產(chǎn)生信號(hào)分子NO，從而達(dá)到舒張血管與持續(xù)抑制卒中進(jìn)一步形成的效果。磁性納米粒子則作為可選擇的外部磁場(chǎng)響應(yīng)劑與MRIT2加權(quán)成像的造影增強(qiáng)成分，適用于在體研究中不同的診斷治療需求?；谇笆鰧?duì)于缺血半影的診斷需求，PAMNs 可作為一種理想的診療一體化材料應(yīng)用于AIS 半影的診斷輔助與一定程度的應(yīng)急治療。事實(shí)上，PAMNs 在本研究中的確表現(xiàn)出了不俗的對(duì)AIS 病灶邊緣的顯影增強(qiáng)效果。

本文基于PAMNs 材料在MRI 診斷缺血半影中的造影增強(qiáng)與治療時(shí)間窗內(nèi)的治療效果進(jìn)行了在體表征與討論，期望可為后續(xù)針對(duì)急性缺血性腦卒中臨床診療的研究與試驗(yàn)提供部分佐證與啟發(fā)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 PAMNs 材料的制備與形貌表征

PAMNs 主要通過(guò)擠壓過(guò)膜法（使得血小板膜、精氨酸與磁性Fe2O3 納米粒子的混合溶液受壓以通過(guò)一定孔徑的納米薄膜）制得。本實(shí)驗(yàn)所用材料的制備流程簡(jiǎn)述如下：

將采集的新鮮單采血小板置于4℃，4000 g 離心、棄上清液并使用生理鹽水重懸，重復(fù)3 次以去除細(xì)胞器，獲得純凈的血小板膜（nPLT）溶液；

取1mg/mL nPLT 溶 液，以50mmol/L 加 入L- 精 氨 酸（Mw=174.2g/mol）、100μg/mL 加入Fe2O3 納米粒子，所得混合溶液置于水浴超聲10 min 充分混勻；

將混合溶液轉(zhuǎn)移至脂質(zhì)擠出器內(nèi)，密封加壓使其通過(guò)800 nm 濾膜以形成囊泡結(jié)構(gòu)，重復(fù)10 次，可制得本實(shí)驗(yàn)所用PAMNs 材料。

材料的水動(dòng)力尺寸、電位特性由Nanosight 納米顆粒跟蹤分析儀（NS300，英國(guó)Malvern 公司）采集，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)通過(guò)透射電子顯微鏡（JEM 2100，日本JEOL 公司）與掃描電子顯微鏡（Ultra Plus，德國(guó)Carl Zeiss 公司）進(jìn)行表征。

1.2 光化學(xué)栓塞致腦卒中小鼠模型的制備

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均根據(jù)東南大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)制定的動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行，該方案經(jīng)東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)利用在小鼠腦皮層區(qū)域形成光化學(xué)栓塞以模擬急性缺血性腦卒中模型[8]。其具體制備操作簡(jiǎn)述如下：

選取6-8 周的SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠（上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），控制體重在20g 左右，以10μL/g體重經(jīng)由腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉劑；

確認(rèn)小鼠進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)后，以10μL/g 體重經(jīng)由尾靜脈注射1%玫瑰紅溶液；

去除小鼠顱頂毛發(fā)并對(duì)該區(qū)域進(jìn)行消毒，以俯臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，剪開(kāi)區(qū)域皮膚以充分暴露前鹵，使得直徑為4 mm 的冷光源束垂直照射在其前鹵右下方約2 mm 的頭骨上，調(diào)節(jié)光強(qiáng)至36，照射15 min 以形成光化學(xué)栓塞，制得急性缺血性腦卒中小鼠模型。

圖1 光化學(xué)栓塞腦卒中模型造模示意

1.3 PAMNs 動(dòng)物模型體內(nèi)磁共振參數(shù)選擇

前述急性缺血性腦卒中模型用于后續(xù)研究時(shí)，藥物（PAMNs 與生理鹽水）均通過(guò)尾靜脈進(jìn)行注射，其造影增強(qiáng)與治療效果則通過(guò)磁共振T2 加權(quán)成像與T2*加權(quán)成像進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)述如下：

將模型小鼠以俯臥位固定于小動(dòng)物磁共振成像系統(tǒng)（Biospec 7T/20 USR，德國(guó)Bruker 公司）的動(dòng)物軌道中，通入體積分?jǐn)?shù)位1.5%的異氟烷氣體麻醉劑以麻醉小鼠，加熱軌道使得小鼠體溫維持在如上37℃，并通過(guò)心率監(jiān)測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)確認(rèn)模型的生命活動(dòng)水平；

設(shè)置實(shí)驗(yàn)所用TurboRARE-T2 序列的掃描參數(shù)為重復(fù)時(shí)間TR=3000.0 ms，回波時(shí)間TE=36 ms，平均數(shù)number of average=8，回波鏈長(zhǎng)度echo train length=8，翻轉(zhuǎn)角flip angle=135.0°，掃 描 矩 陣尺寸為256×256，切 片 厚 度slice thickness=1mm，視場(chǎng)FOV=20mm×20mm；

設(shè)置實(shí)驗(yàn)所用Flash-T2* 序列的掃描參數(shù)為重復(fù)時(shí)間TR=300.0 ms，回波時(shí)間TE=7.5 ms，回波鏈長(zhǎng)度echo train length=1，翻 轉(zhuǎn) 角flip angle=70.0°，切 片 厚 度slice thickness=0.7 mm；

將急性缺血性腦卒中小鼠模型隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組（n=3）。通過(guò)尾靜脈分別向每只實(shí)驗(yàn)組小鼠注射200μLPAMNs 材料，向每只對(duì)照組小鼠注射200μL 生理鹽水，以前述參數(shù)采集其注射前及注射后0.5、1、2、3、4、6 h 時(shí)的腦部區(qū)域圖像。

采集所得MRI 數(shù)據(jù)的灰度統(tǒng)計(jì)分析與T2 影像所表現(xiàn)的病灶面積統(tǒng)計(jì)均采用ImageJ v1.52a 進(jìn)行測(cè)量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 PAMNs 材料的制備與形貌表征

本實(shí)驗(yàn)制備PAMNs 的水動(dòng)力直徑為（111.33±9.24）nm，ζ 電位為（-12.93±1.20）mV。圖2 的SEM 和TEM 結(jié)構(gòu)表征可見(jiàn)，制備所得PAMNs 的表面較為光滑，結(jié)構(gòu)呈穩(wěn)定的微球形。

圖2 PAMNs 形貌照片。a) TEM 與b) SEM 下的PAMN

2.2 PAMNs 材料在磁共振成像中對(duì)缺血半影的造影增強(qiáng)

PAMNs 材料內(nèi)包含的γ-Fe2O3 納米粒子本身具有一定的磁共振T2 與T2*加權(quán)成像的造影增強(qiáng)性能，其表面包覆的血小板膜納米層又使得材料在腦卒中病灶區(qū)域產(chǎn)生了較強(qiáng)的靶向富集性，此兩方面的作用在圖3 所示的對(duì)比時(shí)間序列中都明顯可見(jiàn)（T2 影像初始病灶以黃色箭頭標(biāo)出，T2*影像初始病灶以紅色箭頭標(biāo)出）。

圖3 PAMNs 在MRIT2 與T2＊加權(quán)成像中的造影增強(qiáng)

此外，相比于注射有同劑量生理鹽水的對(duì)照組，注射有PAMNs 材料的小鼠腦卒中區(qū)域的邊緣在兩種成像模式下都產(chǎn)生了顯著的灰度降低，表明PAMNs 材料在病灶邊緣區(qū)域的富集，這可能來(lái)源于腦卒中病灶壞死核心對(duì)PAMNs 遞送產(chǎn)生的阻礙。由于主要血管的栓塞，材料難以通過(guò)血流遞送作用抵達(dá)病灶深層區(qū)域，從而在保留有完整形態(tài)與一定微血流供給的缺血半影區(qū)域形成了低灰度、高對(duì)比度的環(huán)形PAMNs富集層，使得“存在急救價(jià)值的”缺血半影能夠在MRI T2 與T2*序列掃描中被特異性顯影增強(qiáng)。這一效應(yīng)在較為嚴(yán)重的梗死灶中體現(xiàn)得更為明顯。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同的成像條件下，T2 加權(quán)影像表現(xiàn)出更為清晰的病灶形態(tài)，而T2* 加權(quán)影像則表現(xiàn)出相對(duì)更高的對(duì)比度，即更為顯著的缺血半影造影增強(qiáng)效果。兩種成像模式下，缺血半影與其周邊組織的對(duì)比效果隨時(shí)間發(fā)展、PAMNs 在病灶周邊的富集進(jìn)一步增強(qiáng)；與此同時(shí)，PAMNs 對(duì)AIS 病灶的治療效果則引起了一部分輕微栓塞血管的再灌注，隨著材料伴隨再灌注血流的遷移，半影環(huán)形區(qū)域直徑不斷縮小并逐漸被遞送至病灶的更深層區(qū)域。在這種情況下，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為PAMNs 對(duì)AIS 缺血半影的造影增強(qiáng)效果是確實(shí)有效的，且這種特異性增強(qiáng)行為隨著時(shí)間與病灶的發(fā)展仍能夠得到保證，即是說(shuō)：

PAMNs 可基于MRI 手段實(shí)現(xiàn)對(duì)AIS 半影發(fā)展的實(shí)時(shí)監(jiān)控，有利于AIS 的臨床特異性診斷與其后治療策略的制定，并體現(xiàn)出一定的治療效果（在隨后2.3 部分表征）。

2.3 PAMNs 對(duì)AIS 的預(yù)應(yīng)急治療評(píng)價(jià)

由MRIT2 影像體現(xiàn)、以PAMNs 富集環(huán)狀區(qū)域?yàn)檫吘壍募毙匀毖阅X卒中的病灶面積發(fā)展統(tǒng)計(jì)如圖4 所示。為最大限度減小模型個(gè)體差異所造成的誤差，此處采用病灶面積發(fā)展比例來(lái)衡量病灶的相對(duì)增長(zhǎng)趨勢(shì)，定義為：Lesion area development=lesion area (t)/lesion area (t=t0)。

圖4 病灶面積發(fā)展統(tǒng)計(jì)

由統(tǒng)計(jì)圖可見(jiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，注射有PAMNs 材料的模型鼠AIS 病灶發(fā)展無(wú)論在栓塞剛發(fā)生的0.5 h 內(nèi)還是在后續(xù)的完整治療時(shí)間窗6 h 中都表現(xiàn)出了顯著的發(fā)展抑制效應(yīng)。在病灶形成的0.5 h 內(nèi)，可能由于輕微栓塞集中在外部缺血半影區(qū)域，保存有相對(duì)較大的治療余地，對(duì)照組的病灶發(fā)展十分迅猛，而PAMNs 抑制作用的集中大量特性在此期間得以體現(xiàn)；在病灶形成的1-6 h 內(nèi)，可能由于遞送通路、生理電活動(dòng)與功能受限，PAMNs 無(wú)法發(fā)揮理想條件下的治療作用，病灶核心區(qū)域的再灌注表現(xiàn)相對(duì)受到了制約。此外，對(duì)照模型的自愈水平也是需要考慮的因素之一。

綜上所述，PAMNs 可經(jīng)由缺血半影區(qū)域的血流再灌注實(shí)現(xiàn)治療時(shí)間窗內(nèi)對(duì)AIS 病灶發(fā)展的動(dòng)態(tài)性有效抑制，這進(jìn)一步體現(xiàn)了PAMNs 材料在AIS 缺血半影造影輔助方面的優(yōu)勢(shì)，其應(yīng)用于MRI 的診療一體化作用也得到了保障。

3 結(jié)論

本論文通過(guò)建立光化學(xué)栓塞致急性缺血性腦卒中小鼠模型，通過(guò)PAMNs 材料應(yīng)用于該動(dòng)物模型，進(jìn)行MRI 診療一體化的在體表征，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了一種血小板仿生氣體前體藥物納米遞送系統(tǒng)：PAMNs 對(duì)缺血半影的造影增強(qiáng)效果與結(jié)合于病灶實(shí)時(shí)承療水平（血流再灌注）的AIS 發(fā)展動(dòng)態(tài)抑制作用。在此基礎(chǔ)上，本結(jié)論對(duì)廣泛的缺血半影研究而言，將可能作為參考或引起更多有關(guān)納米藥物遞送系統(tǒng)、缺血半影造影增強(qiáng)、MRI 及其他成像技術(shù)用于缺血半影診斷等方面的思考，由此，未來(lái)有關(guān)腦卒中臨床診療策略將可能存在更多選擇。