肺癌患者化療前后血漿let-7a表達(dá)水平與化療藥物療效相關(guān)性分析

彭微 劉潔 袁桂

412000湖南中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南株洲

因肺癌早期癥狀不明顯，常常被患者忽略。近年來(lái)肺癌在我國(guó)發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一。目前，由于肺癌早期診斷率低，多數(shù)肺癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，化療成為肺癌晚期患者最主要治療手段。因此肺癌晚期患者生存率及預(yù)后取決于對(duì)其化療藥物的敏感性。因此，提高晚期肺癌患者化療療效是目前臨床關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。MicroRNA是近年發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)單鏈小分子RNA，對(duì)其的研究已成為一個(gè)新的熱點(diǎn)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，1et-7a 在細(xì)胞內(nèi)影響著基因的表達(dá)調(diào)控，在疾病發(fā)生中具有重要的作用，尤其是在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，let-7a扮演著不可替代的角色。目前有大量研究顯示，miRNAs和腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，提示其可能是一種新型腫瘤標(biāo)記物。因此深入研究miRNAs和肺癌發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，有可能為肺癌的診治提供新靶點(diǎn)[1]。let-7a 是第一個(gè)被報(bào)道與肺癌相關(guān)的miRNA，近年來(lái)越來(lái)越多研究表明，let-7a的表達(dá)水平在腫瘤細(xì)胞對(duì)化療敏感性中起一定調(diào)節(jié)作用。Let-7a在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞中存在明顯差異，因此let-7a 在腫瘤早期診斷方面可能有重要意義。研究證實(shí)，let-7a參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡、個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝以及病毒感染等過(guò)程，并且在多種腫瘤中扮演重要的角色。Let-7a 的表達(dá)水平在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中顯著下調(diào)，而且肺癌和乳腺癌中l(wèi)et-7a 的表達(dá)水平與患者的生存時(shí)間呈正相關(guān)。因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)肺癌晚期患者化療前后let-7a 水平變化，并觀察其與順鉑聯(lián)合5-Fu/CF 化療方案療效的關(guān)系，為逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥提供新的治療靶點(diǎn)，為指導(dǎo)臨床化療用藥提供理論依據(jù)。

資料與方法

選取晚期肺癌患者60例，所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療及細(xì)胞分子靶向等任何治療，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

方法：入院后1次/2周重復(fù)順鉑聯(lián)合5-Fu/CF 化療方案治療，6 個(gè)化療周期后進(jìn)行療效評(píng)估。并采集60例患者化療前后外周血。①血漿標(biāo)本采集：抽取化療前患者清晨空腹外周靜脈血5 mL，6 個(gè)化療周期后再抽取1次，血漿加入EDTA抗凝劑，常溫下4 h內(nèi)處理。4℃下1 200 r/min 離心10 min，血漿和血細(xì)胞分別用1.5 mL 無(wú)RNase 的離心管分裝，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。②血漿總RNA 提?。簩?00 μL 血標(biāo)本 血漿移至1.5 mL 的EP 管中，4℃，1 200 r/min，離心10 min。離心后收集血漿至另一新的EP管中。加入Trizol試劑，Trizol試劑∶血漿比例為1∶0.8。混合均勻，繼續(xù)離心處理。取上層清液。測(cè)定RNA 濃度和純度。③血漿let-7a檢測(cè)：按照上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司 Hairpin-itTM miRNAs qPCR QuantitationKit 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR操作。按照通用反轉(zhuǎn)錄條件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，95℃30 s，95℃10 s，55℃15 s，72℃20 s，循環(huán)40次，每個(gè)樣本重復(fù)3次。另外擴(kuò)增β-actin作為內(nèi)參基因。

療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：療效評(píng)定參照《實(shí)體瘤療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行[2]，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)、疾病進(jìn)展(PD)?？傆行?RR)=(CR+PR)/總例數(shù)×100%。4 周后，CR 或PR 者行CT復(fù)查進(jìn)行療效確認(rèn)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 15.0 軟件處理；計(jì)量資料以(±s)表示，采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

患者化療前后血漿let-7a 表達(dá)情況比較：60例患者化療后血漿let-7a 表達(dá)水平為(2.09±0.37)，顯著低于化療前水平(4.29±0.45)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019 6，P＜0.05)。

let-7a的表達(dá)與化療藥物療效相關(guān)性分析：順鉑聯(lián)合5-Fu/CF 化療方案治療后，對(duì)60例肺癌晚期患者進(jìn)行療效評(píng)估，結(jié)果顯示，化療前血漿let-7a 在(CR+PR)組的表達(dá)量為(2.60±0.47)，明顯低于(PD+SD)組的(4.92±0.50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021 3，P＜0.05)。由此證明，血漿let-7a 的表達(dá)有可能與化療藥物療效存在相關(guān)性。抑制let-7a 的表達(dá)可以增加患者對(duì)化療藥物的敏感性。而let-7a高表達(dá)也可提示對(duì)鉑類(lèi)藥物化療的抵抗。

討 論

肺癌患者早期主要表現(xiàn)為咳嗽、咳血、胸痛、胸悶氣短、貧血等癥狀，病情易被掩蓋或忽略。肺癌患者發(fā)現(xiàn)往往病情已進(jìn)展至晚期，具有較高死亡率。對(duì)于此類(lèi)患者，臨床通常多采用化療方法治療。然而多數(shù)化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)，化療藥物細(xì)胞毒作用的無(wú)選擇性和對(duì)宿主全身不良反應(yīng)限制了療效的提高，從而使化療不能順利進(jìn)行[3]。因此，如何提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，增加化療藥物療效，已成為臨床關(guān)注重點(diǎn)，同時(shí)也是提高肺癌晚期患者生存率的關(guān)鍵。

Let-7a 作為一種抑癌基因在肺癌、乳腺癌、前列腺癌中表達(dá)顯著下調(diào)。Let-7a靶向抑制c-Myc，使c-Myc所激活的細(xì)胞增殖信號(hào)通路失活。K-Ras 是信號(hào)通路EGFR/RAS/MAPK 中的關(guān)鍵分子，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移中發(fā)揮重要作用。

Let-7a 可以通過(guò)下調(diào)k-RAS 及HMGA2 基因的表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞的侵襲及增殖。研究證實(shí)Let-7 低表達(dá)的肺癌患者復(fù)發(fā)時(shí)間短，預(yù)后不良。將Let-7a 構(gòu)建到A549 肺癌細(xì)胞株中，通過(guò)皮下種植、尾靜脈注射接種小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)let-7a 能抑制肺癌的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。

Sorrentino 等[4]研究表明let-7 家族的異常表達(dá)可以影響腫瘤對(duì)紫杉醇、阿霉素等化療藥物的敏感性。Chang 等[5]研究顯示let-7g 表達(dá)水平與使用順鉑聯(lián)合5-FU 或希羅達(dá)(CF)的晚期胃癌患者從治療到進(jìn)展時(shí)間(TTP)呈正相關(guān)。Yang等[6]發(fā)現(xiàn)在接受含鉑類(lèi)化療方案的患者中，化療耐藥患者腫瘤組織中的let-7i 表達(dá)顯著下降，進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)let-7i與卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥相關(guān)。Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn)let-7i 的低表達(dá)與接受奧沙利鉑+亞葉酸鈣+5-FU(FOLFOX4)新輔助化療的不良病理緩解及預(yù)后相關(guān)。魏彥玲等[8]發(fā)現(xiàn)let-7f 在胃癌阿霉素耐藥細(xì)胞株SGC7901/ADR 中的表達(dá)顯著降低，逆轉(zhuǎn)let-7f 表達(dá)可增加其對(duì)阿霉素耐藥性。

順鉑是肺癌治療中非常經(jīng)典的化療藥物，已被廣泛用于治療肺癌。目前臨床主要采用順鉑聯(lián)合5-Fu/CF 化療方案。國(guó)內(nèi)外臨床研究顯示，順鉑聯(lián)合5-Fu/CF化療方案復(fù)發(fā)率較低，能夠顯著提高患者生存率，具有較好臨床效果[9]。本研究以我院收治肺癌晚期患者60例為研究對(duì)象，檢測(cè)其化療前、后血漿let-7a的表達(dá)變化，分析let-7a 水平與化療藥物療效的相關(guān)性。結(jié)果顯示，肺癌晚期患者化療后let-7a 水平明顯低于化療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說(shuō)明順鉑聯(lián)合5-Fu/CF 化療方案能夠影響let-7a 的表達(dá)水平，提示順鉑聯(lián)合5-Fu/CF 化療方案可能通過(guò)降低血漿中l(wèi)et-7a的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤的發(fā)展。與此同時(shí)，(CR+PR)患者血漿中l(wèi)et-7a 表達(dá)低于(SD+PD)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示血漿let-7a 的表達(dá)可能與化療藥物的療效存在相關(guān)性。說(shuō)明，血漿let-7a 有可能成為預(yù)測(cè)化療藥物療效的潛在性生物指標(biāo)。