甲殼素對(duì)葡萄園土壤微生物群落組成的影響

李芬，董書甲，趙攀，趙新節(jié)，何熹

(齊魯工業(yè)大學(xué)山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250353)

甲殼素，又名幾丁質(zhì)，是一類天然多糖類高分子化合物，具有很好的生物安全性、生物相容性和生物可降解性，被廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、保健品、化妝品和紡織等眾多領(lǐng)域之中[1]。作為土壤改良劑，甲殼素含有豐富的碳和氮元素，使得甲殼素被微生物分解利用后可以用它來作為植物生長的養(yǎng)分，使得土壤中的微生物體系得到改善[2]。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的成員，能夠利用有機(jī)質(zhì)作為營養(yǎng)及能量來源，與土壤酶共同參與土壤各種化學(xué)反應(yīng)和生物化學(xué)過程，其生物量及數(shù)量分布可以敏感地反映土壤環(huán)境質(zhì)量的變化[3]。土壤微生物對(duì)植株的生長有良好的促進(jìn)作用[4-7]。趙春燕等發(fā)現(xiàn)，添加甲殼素的土壤中自生固氮細(xì)菌、纖維分解細(xì)菌、乳酸細(xì)菌和放線菌等有益菌數(shù)量顯著增加，酵母菌數(shù)量略有增加，而常見的霉菌和其它絲狀真菌的數(shù)量明顯減少[8]。尹秀蓮等[9]通過對(duì)甲殼素及其衍生物的研究發(fā)現(xiàn)，甲殼素低聚糖對(duì)革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出強(qiáng)抑制作用。土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)失衡，尤其是土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)的變化是引起連作障礙的主要原因[10]。王艷芳等[11]研究了甲殼素對(duì)連作條件下平邑甜茶幼苗生長及土壤環(huán)境的影響，發(fā)現(xiàn)甲殼素對(duì)真菌的生長有明顯的抑制作用而對(duì)細(xì)菌的生長有促進(jìn)作用；改變了土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)，從而改善了連作土壤環(huán)境，有效緩解了平邑甜茶的連作障礙。本研究以甲殼素處理葡萄園土壤，采用細(xì)菌16S rDNA[細(xì)菌染色體上編碼16S rRNA(核糖體RNA)相對(duì)應(yīng)的DNA序列]、真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)測(cè)序，對(duì)土壤中的細(xì)菌和真菌種類組成及數(shù)量進(jìn)行分析，從而了解甲殼素添加對(duì)葡萄園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

試驗(yàn)在山東省萊西市沽河街道辦事處曲家莊村(葛洪強(qiáng)葡萄園)進(jìn)行，試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)處理：①對(duì)照組，土壤中不添加甲殼素。②試驗(yàn)組，土壤中添加甲殼素。各處理面積均為666.7m2。

試驗(yàn)所用甲殼素為濟(jì)南阿波羅甲殼素肥業(yè)有限公司生產(chǎn)的963牌養(yǎng)根素(其主要成分為蝦蟹殼生產(chǎn)的殼聚糖，含量為60～80g/L)，隨基肥施入，離植株60cm開30cm深的溝施入，每年1次，每666.7m2用量300g(折合純甲殼素的量)，2009～2014年連續(xù)6年施入。

2015年進(jìn)行土壤樣品采集。隨機(jī)選取添加甲殼素和未添加甲殼素的土壤區(qū)域，每個(gè)區(qū)域選3處取樣，每處采用對(duì)角線五點(diǎn)取樣法采集土壤樣品，將三次樣品混勻。取樣時(shí)去除地表面的植物等殘?bào)w，用土鏟垂直切開土壤，取0～20cm土層的土壤，挑出碎石、植物殘根后，將土壤樣本裝入無菌自封袋中，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室后送檢。應(yīng)用Illumina Misq測(cè)序平臺(tái)(華大基因)進(jìn)行分析。

1.2 高通量測(cè)序分析

基因測(cè)序的總體工作流程大致為：①土壤DNA粗提。土壤中微生物原基因組DNA的提取采用Mag-Bind Soil DNA Kit Protocol試劑盒(OMEGA)。②樣品PCR。分別利用細(xì)菌16S rDNA和真菌ITS通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物-20℃保存。③PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。采用DL2000 Marker、1%的瓊脂糖凝膠，110V恒壓對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳35分鐘，凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。④高通量測(cè)序。使用Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒對(duì)真菌、細(xì)菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。采用Life Qubit 3.0對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行濃度定量，構(gòu)建真菌、細(xì)菌文庫。將樣品(文庫)逐步稀釋到4nm，按1∶1加入氫氧化鈉室溫變性5分鐘，加入HT1 Buffer預(yù)冷，然后進(jìn)行高通量上機(jī)測(cè)序[12]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

下機(jī)后，采用雙峰(pair-end)測(cè)序法舍棄原始數(shù)據(jù)(Raw reads)中的低質(zhì)量序列(保證50個(gè)連續(xù)堿基的平均質(zhì)量大于Q30)。用Flash軟件，過濾對(duì)接上的序列(連續(xù)相同的堿基個(gè)數(shù)小于6，模糊堿基個(gè)數(shù)小于1)，設(shè)計(jì)無法對(duì)接的序列，得到最終用于OTU(operational taxonomic unit)分析的序列(Clean reads)。

采用Uparse 軟件將相似度達(dá)97%以上的序列歸為一個(gè)操作分類單元即OTU；聚類所有序列(Ucl法)，參照RDP(Ribosomal Database Project)數(shù)據(jù)庫，采用貝葉斯算法注釋每個(gè)分類中的OTU代表序列，得到每個(gè)OTU的分類學(xué)信息。分別利用Greengene、UNITE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行細(xì)菌及真菌的物種注釋。根據(jù)OTU使用mothur軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析，包括Observed species指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，使用R軟件(V3.1.1)繪制稀釋曲線、Rank abundance曲線、物種累積曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU統(tǒng)計(jì)及豐度分析

物種豐富度是指群落中物種數(shù)目的多少。物種均勻度是指一個(gè)群落或環(huán)境中的全部物種數(shù)目個(gè)體數(shù)目的分配狀況；物種數(shù)目越多，多樣性越豐富，物種數(shù)目相同時(shí)，每個(gè)物種的個(gè)體數(shù)越平均，則多樣性越豐富[13]。OTU Rank曲線能夠體現(xiàn)樣品的物種多樣性，可以同時(shí)解釋樣品多樣性的兩個(gè)方面，即樣品所含物種的豐富度和均勻度。物種的豐富程度由曲線的橫軸長度來反映，曲線越寬，說明樣品中物種組成越豐富。樣品中物種的均勻度由曲線縱軸的形狀來反映，曲線越平坦，說明樣品中物種組成的均勻度越高。由圖1與圖2可知，試驗(yàn)組的細(xì)菌和真菌OTU Rank曲線圖要比對(duì)照組的平坦且橫軸長度長。由此可得，試驗(yàn)組所含細(xì)菌和真菌群落的均勻度和豐富度要比對(duì)照組好，而且細(xì)菌的物種群落要比真菌的豐富且均勻度更高。

圖1樣品的細(xì)菌OTU Rank曲線圖

圖2 樣品的真菌OTU Rank曲線圖

2.2 Alpha多樣性分析

通過對(duì)供試土壤組進(jìn)行16S rDNA及ITS高通量測(cè)序，共獲得747336條原始數(shù)據(jù)，700780條過濾數(shù)據(jù)。在97%相似度下，細(xì)菌獲得5661個(gè)OTU，真菌獲得481個(gè)OTU。每個(gè)土壤樣品的序列數(shù)及OTU數(shù)及Alpha多樣性值見表1。

由表1可知，試驗(yàn)組的Observed species指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)以及Shannon指數(shù)均比對(duì)照組的大，Simpson指數(shù)比對(duì)照組要小。Chao和Ace指數(shù)可反映群落物種豐富度，Shannon和Simpson指數(shù)可反映群落物種多樣性。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的細(xì)菌和真菌群落的物種豐富度高、均勻度大，具有更大的群落多樣性，即土壤微生物種類增多，有助于土壤有機(jī)質(zhì)及養(yǎng)分的積累，有利于植物的生長發(fā)育與繁殖。

表1 葡萄園土壤測(cè)序序列和Alpha多樣性分析

2.3 物種注釋分析

由于樣品中所檢測(cè)出的微生物種類繁多，許多物種含量十分少，以物種的豐度大于0.5%作為劃分依據(jù)。由表2可得，對(duì)照組土壤中的細(xì)菌門類主要為變形菌門、酸桿菌門、浮霉菌門和厚壁菌門，試驗(yàn)組土壤中的主要為變形菌門、酸桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和浮霉菌門。加入甲殼素后，土壤中細(xì)菌群落相對(duì)豐度增加較大的是擬桿菌門和厚壁菌門，分別增加了193.52%和47.45%；泉古菌門和疣微桿菌門則分別減少了47.30%和46.61%。

由表3可得，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，主要真菌中，子囊菌門增加了129.25%，擔(dān)子菌門增加了47.24%，接合菌門減少了80.06%。

從屬分類水平看，由表4可看出，兩組土壤樣品的細(xì)菌所占比例差距較大，試驗(yàn)組的亞硝化螺菌假絲酵母屬、紅游動(dòng)菌屬和慢生根瘤菌屬等所占比例明顯少于對(duì)照組，浮霉菌屬、腸球菌屬和芽孢桿菌屬等所占比例明顯多于對(duì)照組。

從表5可看出，在兩組樣品土壤微生物中，真菌種類大致相同，但試驗(yàn)組的土赤殼屬、枝孢屬和外瓶霉屬等所占比例明顯低于對(duì)照組，紅酵母屬、蟲草屬、隱球菌屬和被孢霉屬等種類所占比例明顯高于對(duì)照組。

表2 對(duì)照組和試驗(yàn)組門水平的細(xì)菌主要群落相對(duì)豐度(%)

表3 對(duì)照組和試驗(yàn)組門水平的真菌主要群落相對(duì)豐度(%)

表4 對(duì)照組和試驗(yàn)組屬水平的細(xì)菌主要群落相對(duì)豐度(%)

表5 對(duì)照組和試驗(yàn)組屬水平的真菌主要群落相對(duì)豐度(%)

3 討論

本研究通過16S rDNA及ITS高通量測(cè)序，分析了添加甲殼素(試驗(yàn)組)與未添加甲殼素(對(duì)照組)的土壤細(xì)菌與真菌群落結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果表明，添加甲殼素后，土壤中的細(xì)菌及真菌物種豐富度、均勻度及物種多樣性均有明顯的提高。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，主導(dǎo)著養(yǎng)分循環(huán)和能量流動(dòng)，對(duì)維持系統(tǒng)的穩(wěn)定性及可持續(xù)性具有重要作用[14]，且微生物參與大約90%的土壤反應(yīng)過程[15]，故其種類的增多在一定程度上有助于土壤有機(jī)質(zhì)及養(yǎng)分的積累，有利于植物的生長發(fā)育與繁殖。

添加甲殼素后，土壤中細(xì)菌與真菌中的微生物群落組成比例均有所變化。從門類水平來看，土壤中擬桿菌相對(duì)豐度明顯提高，擬桿菌門可以通過降解纖維素、果膠和其他復(fù)雜的碳?xì)浠衔餅橹参锾峁┨厥獾臓I養(yǎng)[16]；試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，絲狀真菌的相對(duì)豐度減少，說明甲殼素對(duì)絲狀真菌有一定的抑制作用，這與趙春燕[8]通過不同濃度的甲殼素灌根處理盆栽番茄來探究其對(duì)土壤微生物的影響研究相一致。從屬類水平來看，土壤中細(xì)菌浮霉菌屬、芽孢桿菌屬，真菌被孢霉屬的相對(duì)豐度明顯提高，而真菌枝孢屬的相對(duì)豐度明顯受到抑制。浮霉菌屬可以參與氮、碳、硫循環(huán)，進(jìn)行多種循環(huán)代謝，富集礦物質(zhì)，增強(qiáng)土壤肥力[17]；芽孢桿菌屬可以代謝碳源[16]，具有保濕、抑植物病菌的作用，對(duì)植物有促生作用[18]；被孢霉屬能分解土壤中的糖類和簡(jiǎn)單多糖[19]，為植物提供營養(yǎng)元素；枝孢屬為植物致病菌，可寄生于植物各地上部分引起病害[20]?？偟膩碚f，甲殼素能夠增加土壤微生物的物種種類與生物量，提高大部分有益菌的相對(duì)豐度，抑制部分有害菌的生長，有利于土壤中有機(jī)質(zhì)與營養(yǎng)的積累，改善土壤環(huán)境。