一種高純度纈草三酯的制備工藝

浦紹敬 李劍峰 王小婷

【摘?要】?目的：提供一種制備高純度纈草三酯的工藝方法。方法：該工藝包括，利用超臨界CO2萃取蜘蛛香的揮發(fā)油與非揮發(fā)性組分，同時實現(xiàn)解析分離;采用柱層析純化，用不定型正相硅膠作固定相，乙酸乙酯和石油醚（V∶V=15∶85）作流動相洗脫。?結果：連續(xù)兩次洗脫即可得到高純度纈草酸酯，室溫下呈淡黃色油液，相對浸膏收率18.6%。其化學結構經(jīng)NMR和MS表征，確定是4-（乙酰氧甲基）-6，7-二氫-1H-螺[環(huán)戊烷][c]吡喃-7，2'-環(huán)氧乙烷〗-1，6-雙-3-纈草酸酯，CAS?NO.?18296-44-1。結論：該工藝提取效率高，提取過程中目標物不被破壞，純化方法簡單，損失小，得到的纈草三酯純度高，為后續(xù)藥理及活性研究提供可靠的原料保障。

【關鍵詞】?乙酰纈草三酯;纈草三酯;超臨界萃取;蜘蛛香;環(huán)烯醚萜類

【中圖分類號】R284.2?【文獻標志碼】?A【文章編號】1007-8517（2019）22-0032-04

A?Preparation?Process?of?High?Purity?Valepotriate

PU?Shaojing1?LI?Jianfeng2*?WANG?Xiaoting1

1.Shureli?Biopharma?Co.，Ltd.Kunming?650000，China;

2.School?of?traditional?Chinese?Medicine，?Yunnan?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，Kunming?650000，China

Abstract：Objective?A?novel?process?was?provided?about?the?preparation?of?valepotriate?with?high?purity.Methods?The?process?encompassed?two?sections.?The?first?section?achieved?primary?separation?whereby??the?volatiles?and?the?non-volatiles?were?extracted?with?supercritical?liquid?carbon?dioxide?and?subsequently?partitioned?to?different?units.??In?the?second?section，?the?non-volatile?fraction?was?further?purified?with?silica?gel?column?chromataography，?eluted?with?mixed?solvents?of?ethyl?acetate?and?petroleum?ether?（15∶85?v/v）.?Results?After?repetition?of?chromatography?by?once，?valeriene?with?91%?purity?（HPLC）?was?obtained.?The?product?was?a?yellow?oil.?The?yield?was?18.6%?based?on?the?crude?extract.?The?structure?of?the?product?was?established?by?comparing?the?NMR?and?MS?data，?which?was?valepotriate?（CAS.?18296-44-1）.?Conclusion?The?process?features?high?yield，?mild?conditions，?easy?purification?and?low?loss.?The?product?valepotriate?thus?obtained?has?fairly?high?purity，?which?can?be?used?in?the?subsequent?studies?on?the?pharmaceutical?and?biological?activities?thereof.

Keywords：Valeriene;?Valepotriate;?Supercritical?CO2?Extraction;Valeriana?jatamansi?Jones;?Iridoids

蜘蛛香（Valeriana?jatamansi?Jones）是敗醬科（Valerianaceae）纈草屬植物蜘蛛香或V.?wallichii?DC的根莖，又名馬蹄香、鬼見愁、豆菜根、九轉香、雷公七、小馬蹄香、臭狗藥、磨腳花、老龍須、香草子、養(yǎng)血蓮、臭藥、烏參、大救駕、老虎七等[1-3]。蜘蛛香為多年生草本植物，主要分布在我國西南地區(qū)，資源豐富，曾收錄于2010年版中國藥典，具有理氣止痛、消食止瀉、祛風除濕、鎮(zhèn)靜安神的功效，常用于腹脘脹痛、食積不化、腹瀉痢疾、風濕痹痛、腰膝酸軟、失眠等，纈草三酯是蜘蛛香主要活性成分和質量控制指標[4]。蜘蛛香的化學成分主要包括揮發(fā)油、環(huán)烯醚萜類和黃酮類化合物[5]，研究表明，蜘蛛香中的環(huán)烯醚萜類成分有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗病毒、解痙、舒張血管、松弛平滑肌和抗腫瘤等活性[6-10]。纈草三酯的化學結構在1982年已有報道，其從印度纈草中提取分離而得，含量較少。該結構經(jīng)過證實具有很好的腫瘤細胞毒性，一定劑量即可殺死肝癌細胞，且未見妊娠毒性和其他毒性[11]。纈草三酯與乙酰纈草三酯化學結構相似，具有一定的穩(wěn)定性，能經(jīng)受短時強光照射和高溫，能耐受一定的酸性，對堿性不耐受，降解主要表現(xiàn)為酯鍵的水解[5]。本研究的主要意義在于，該工藝可以解決傳統(tǒng)提取工藝提取效率低、產(chǎn)物損失大、環(huán)境友好性差、藥材浪費等缺點。該工藝提取時間短、無廢氣廢水、收率高、不破壞活性成分，是目前蜘蛛香提取的最佳工藝。

1?儀器、設備和試藥

1.1?儀器?島津L2030?HPLC，VWD檢測器，工作站版本V?5.87;AB265-S分析電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;BRUKER?AVⅢ?HD?600核磁共振波譜儀;Agilent?6470?Triple?Quad?LC/MS液質連用儀。

1.2?設備?TH22-50*2中型超臨界CO2萃取設備（上海成東科技有限公司）;EZ?PLUX?200D型中低壓制備液相（利惠科技）。TH22-50*2中型超臨界CO2萃取設備的結構包括：2個50?L萃取罐、1個二級分離罐、1個三級分離罐和一個冷凝器，萃取罐可交替使用，冷凝器用于CO2回收。

1.3?試劑與藥材?乙酸乙酯、石油醚（二類）均為分析純，乙腈為色譜純（默克公司），水為娃哈哈瓶裝純凈水。蜘蛛香藥材購自云南白藥集團股份有限公司中藥飲片分公司、?云南向輝藥業(yè)有限公司和昆明道地中藥飲片廠。有切片和未切片兩種，生產(chǎn)日期均已超過兩年。

2?方法

2.1?超臨界萃取?將切片與未切片的蜘蛛香藥材分別粉碎，無需過篩。分別裝入萃取釜中，調節(jié)萃取溫度50～55?℃，待溫度達到后開啟CO2流量，控制在38～40kg/h范圍內，控制萃取壓力在30～35Mpa范圍內;一級分離罐解析壓力調節(jié)為10～15Mpa，溫度為40～45℃;二級分離罐解析壓力調節(jié)為2～5Mpa，溫度為20～25℃，連續(xù)萃取120min。非揮發(fā)性組分儲存于一級分離罐的下部，揮發(fā)油儲存于二級分離罐的下部，少量揮發(fā)油被攜帶到三級分離罐和冷凝器，提取完成后與二級分離罐合并。

2.2?純化?以300～400目正相不定型硅膠作為固定相，濕法上樣，以乙酸乙酯與石油醚體積比15∶85作為流動相進行洗脫，收集UV?254nm集中吸收部位，將該部位濃縮后進行第二次柱層析，降低乙酸乙酯與石油醚的比例至10∶90，濃縮既得黃色油狀液體。

2.3?含量測定?取上述2.2油狀液體2mg，加乙腈10mL溶解，取1.5mL溶液過0.22um濾膜備用。使用島津L2030?HPLC進行純度分析，采用面積歸一化法計算相對含量。色譜柱：WondaSil?C18?Superb（4.6mm×250mm，5μm）;柱溫：30?℃;流動相：乙睛∶水=70∶30，等度洗脫;流速：1.0mL/min;檢測波長：?254nm;進樣量：2μL。

2.4?結構分析

2.4.1?NMR?取上述2.2油狀液體10mg于核磁管中，加入0.5mL氘代氯仿溶解，置BRUKER?AVIII?HD?600核磁共振波譜儀，分別掃描1H?NMR和13C?NMR。

2.4.2?MS?取上述2.2油狀液體0.1mg，加甲醇1.5mL溶解，過0.22μm濾膜備用。取1μL注入Agilent?6470?Triple?Quad?LC/MS液質連用儀，F(xiàn)ragmentor?165，掃描范圍m/z：?50～1000。

3?結果與討論

3.1?意義?近年來，關于蜘蛛香活性成分和臨床運用的相關研究越來越多，且蜘蛛香是目前臨床用于治療嬰幼兒腹瀉效果最佳的中成藥。對于蜘蛛香各組分的生物活性研究已經(jīng)清楚，但鮮見提取純化方面有何進展。本實驗提供一種全新高效提取工藝，彌補蜘蛛香提取工藝的缺失和缺陷。目前云南大健康產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，中藥現(xiàn)代化就是其中非常重要的一項工作，先進的提取工藝可以推動中藥現(xiàn)代化的進程。

3.1?結構確認?上述2.2所得黃色油液經(jīng)MS確認分子量與圖4所示結構相同。ES-MS?（m/z）：445.1844[M+Na]+。經(jīng)核磁表征，1H?NMR、13C?NMR與已知文獻數(shù)據(jù)對比完全一致[13]：1H?NMR（600?MHz，CDCl3）?δ?6.68?（s，?1H），?5.96?（dd，J=10.1，4.5?Hz，?1H），5.85（t，J=2.8?Hz，1H），5.37-5.33（m，1H），4.74-4.62（m，?2H），3.42（dd，J=10.1，2.5?Hz，?1H），3.02（dd，J=10.0，?5.0?Hz，1H），2.89（d，J=4.9?Hz，?1H），2.23-2.20（m，?2H），2.17（d，J=7.1?Hz，?2H），2.14-2.06（m，?2H），2.04（s，?3H），0.98（s，?3H），0.97（s，?3H），0.94（s，?3H），0.93?（s，?3H）;13C?NMR（151?MHz，?CDCl3）δ172.42，170.82，170.27，148.47，140.93，118.64，108.35，92.58，83.05，64.16，60.81，47.86，43.37，43.04，43.02，25.81，25.59，22.33，22.31，22.30，22.21，20.91.?以上數(shù)據(jù)確認該工藝所得纈草三酯化學結構正確無誤。

3.2?切片對含量的影響?實驗證實，相同提起工藝下，未切片蜘蛛香原藥材中揮發(fā)油占比5%～6%，非揮發(fā)性成分占比3.5%～4.2%;經(jīng)過切片的蜘蛛香飲片中揮發(fā)油占比2%～3%，非揮發(fā)性成分占比約1%，且隨著切片時間越長，含量越低。蜘蛛香的主要成分是揮發(fā)油、環(huán)烯醚萜類和黃酮類，飲片切片工藝直接破壞蜘蛛香原有保護層，導致?lián)]發(fā)油和環(huán)烯醚萜類成分更容易揮發(fā)和破壞。飲片生產(chǎn)工藝不適用于蜘蛛香藥材，蜘蛛香藥材最佳保存條件應該是陰涼避光全株保存。

3.3?超臨界CO2萃取技術用于蜘蛛香提取的優(yōu)點?沸點較低，蒸餾試驗發(fā)現(xiàn)，常壓下?lián)]發(fā)油沸點集中在95～110?℃范圍內;另外，環(huán)烯醚萜類化合物在高溫下易壞。傳統(tǒng)提取方法往往采用高溫蒸煮，在提取過程中，揮發(fā)油和纈草三酯損失嚴重，超臨界CO2萃取技術可以避免上述缺陷。除此之外，超臨界CO2萃取技術還具有如下優(yōu)點：①?效率高，時間短，無需清洗，可連續(xù)生產(chǎn);②?條件溫和，收率高，提取過程中損失較小;③?無溶劑，無需做任何除溶劑處理;④?分離效果好，可以直接將揮發(fā)油與其他成分分離;⑤?得到的浸膏中纈草三酯含量較高，便于后續(xù)純化。

3.4?關于后續(xù)純化方法的建議?本實驗使用中低壓過柱，無法達到更高的分離度，只對纈草三酯進行初步分離。HPLC圖譜如圖1所示，纈草三酯的保留時間13.4?min，其主要雜質分別位于12.7?min和17.0?min處，據(jù)核磁數(shù)據(jù)分析，推測雜質可能是纈草三酯的類似物。核磁HNMR圖譜和CNMR圖譜分別如圖2、圖3所示，未發(fā)現(xiàn)明顯雜質峰。實驗不對雜質進行研究，在此不做討論。后續(xù)分離，建議采用正相高壓制備液相進行純化，使用目數(shù)更小的硅膠做固定向，采用梯度洗脫，達到更好的分離效果。

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（收稿日期：2019-08-15?編輯：程鵬飛）