葛芪平渴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

辛玲歌 趙銳

【摘?要】?目的：探討葛芪平渴丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜定性鑒別法（TCL）對(duì)葛芪平渴丸處方中葛根、薏苡仁、黃連進(jìn)行薄層色譜定性鑒別;采用高效液相色譜法（HPLC），建立制劑中葛根素含量的測(cè)定方法。結(jié)果：薄層色譜（TCL）特征斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)，陰性無干擾;葛根素含量在0.196～0.980?μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.9998，n=6），平均回收率為98.68%（RSD=0.68%，n=6）。結(jié)論：所建立的方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可用于葛芪平渴丸的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】?葛芪平渴丸;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);薄層色譜;高效液相色譜

【中圖分類號(hào)】R284.1?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】?A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）21-0021-05

Study?on?Quality?Standard?of?Geqipingke?Pilula

XIN?Lingge?ZHAO?Rui*

The?Second?Affiliated?Hospital?of?Shaanxi?University?of?Chinese?Medicine，Xianyang?712000，China

Abstract：Objective?To?establish?a?quality?standar?for?Hospital?preparation?Geqipingke?Pilula.?Methods?The?kudzu?root，coicis?semen?and?coptis?chinensis?in?Geqipingke?Pilula?were?identified?by?thin?layer?chromatography（TLC），while?the?content?of?puerarin?in?Geqipingke?Pilula?were?determinated?by?high?performance?liquid?chromatography（HPLC）.Results?TLC?results?were?clear，specific，negative?and?without?interference;?puerarin?showed?a?good?linear?relationship?in?the?range?of?0.196～0.980μg?（r=0.9998，n=6）.The?average?recovery?was?98.68%（RSD=0.68%，n=6）.Conclusion?The?method?is?accurate?and?stable，which?is?suitable?for?the?quality?control?of?Geqipingke?Pilula.

Keywords：Geqipingke?Pilula;?Quality?Standard;?TLC;?HPLC

“葛芪平渴丸”是我院脾胃腎病科名老中醫(yī)以辨證論治為基礎(chǔ)，根據(jù)中醫(yī)藥理論，結(jié)合臨床實(shí)踐，總結(jié)多年的經(jīng)驗(yàn)組方，由葛根、黃連、薏苡仁、熟地黃等14味中藥材組成，具有益氣健脾、清熱生津、活血化瘀的功效，臨床上多用于Ⅱ型糖尿病合并肥胖、血脂異常、胰島素抵抗屬氣陰兩虛，熱毒夾瘀者，可有效控制Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥。通過長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用和對(duì)患者的隨訪，該方療效顯著，不良反應(yīng)及毒副作用小，使用安全，且價(jià)格低廉，深受廣大患者的好評(píng)。方中葛根為君藥，為豆科植物野葛?Pueraria?lobata（Willd.）?Ohwi的干燥根，多于秋、冬二季采挖。味甘、辛，性涼。歸脾胃肺經(jīng)，具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉的功效。臨床多用于外感發(fā)熱、口渴、消渴等癥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，葛根素能夠減少Ⅱ型糖尿病模型小鼠體內(nèi)蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、真核起始因子?2a（eIF2a）和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）含量，降低腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性，達(dá)到降低血糖作用[2]。葛根總黃酮通過降低Ⅱ型糖尿病模型大鼠體內(nèi)血清中還原型谷胱甘肽（GSH）、一氧化氮合成酶（NOS）等含量，提升胰腺組織相關(guān)蛋白酶表達(dá)，達(dá)到降低血糖、血脂作用[3]。

中藥方劑大多以傳統(tǒng)的湯劑劑型為主，然而湯劑在煎煮前需浸泡，煎煮過程中需控制煎煮時(shí)間及次數(shù)，遇到特殊中藥材需用特殊的方法進(jìn)行煎煮，并且湯劑在服用時(shí)具有口感差、服用量大、易變質(zhì)、攜帶不便等缺點(diǎn)，給現(xiàn)代生活節(jié)奏越來越快的人們帶來了諸多不便。為了方便患者服用，適應(yīng)時(shí)代的發(fā)展，我院藥劑科制劑室對(duì)湯劑劑型進(jìn)行改良，研制了葛芪平渴丸，方便患者的服用與攜帶，市場(chǎng)前景廣闊，具有開發(fā)意義。為保證葛芪平渴丸的質(zhì)量，本研究從薄層色譜法、高效液相色譜法兩方面入手，制定該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為臨床安全用藥提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?Agilent?1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）、YP5002電子天平（瑞士梅特勒儀器有限公司）、DYQC型醫(yī)用超聲波提取器（連云港歐倍潔醫(yī)療設(shè)備有限公司）、DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）、HH-2電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）、ZF-20D型暗箱式紫外分析儀（上海光豪分析儀器有限公司）。

1.2?試藥?葛根素對(duì)照品（批號(hào)：110752-201514）。葛根對(duì)照藥材（批號(hào)：121551-201601）、薏苡仁對(duì)照藥材（批號(hào)：121254-201203）、黃連對(duì)照藥材（批號(hào)：120913-201109）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。甲醇為色譜純（天津歐密科試劑公司）、其他所用化學(xué)試劑均為分析純、娃哈哈純凈水。

1.3?葛芪平渴丸?由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供，規(guī)格為：?每45丸約重6?g。批號(hào)為：150112、150114、150116。

2?方法與結(jié)果

2.1?薄層色譜鑒別[4]

2.1.1?葛根[5-7]?取適量葛芪平渴丸置于研缽中，研細(xì)，稱取粉末10.7?g，置于具塞的錐形瓶中，量取并加入甲醇30?mL，放入超聲儀，20?min后取出，取濾液蒸干，精密量取甲醇0.5?mL使殘?jiān)芙?，即為供試品溶液。稱取葛根對(duì)照藥材0.8?g，葛根對(duì)照藥材溶液的制備方法同上。再取不含葛根的其他藥材，同樣品制備工藝制備葛根陰性對(duì)照樣品，稱取陰性對(duì)照品10.5?g，同法制成葛芪平渴丸葛根陰性對(duì)照品溶液。參照（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502），精密吸取供試品溶液、葛根對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10?μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開劑的比例為：三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25），展開，取出，晾干，置紫外光燈（365?nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果如圖1所示。

2.1.2?薏苡仁[8]?葛芪平渴丸放于研缽中，研細(xì)，準(zhǔn)確稱取粉末?25.3?g，置于具塞的錐形瓶中，量取并加入石油醚（60～90?℃）100?mL，超聲儀?30?min后取出，取濾液蒸干，精密加入石油醚（60～90?℃）1?mL使殘?jiān)芙猓礊楣┰嚻啡芤?。稱取薏苡仁對(duì)照藥材1.2?g，薏苡仁對(duì)照藥材溶液制備方法同上。再取除薏苡仁藥材外的其他藥材，按處方中藥味比例及葛芪平渴丸的工藝制成陰性對(duì)照品，稱取陰性對(duì)照品25.6?g，同葛芪平渴丸供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，準(zhǔn)確吸取上述三種溶液各10?μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90?℃）-乙酸乙酯-醋酸（25∶5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365?nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。如圖2所示。

2.1.3?黃連[9-10]?葛芪平渴丸研細(xì)，稱取粉末20.3?g，放入具塞的錐形瓶中，量取并加入50?mL甲醇，冷浸1?h后，取濾液低溫蒸干，精密加入甲醇1?mL溶解殘?jiān)?，即為供試品溶液。稱取黃連對(duì)照藥材2.4?g，黃連對(duì)照藥材制備方法同上。再取不含黃連的其余藥材，按處方中藥味比例、工藝制成不含黃連的陰性樣品，稱取陰性對(duì)照品20.6?g，同葛芪平渴丸供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液、黃連對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照品溶液各5?μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5）為展開劑，在另側(cè)槽中加入與展開劑等體積的濃氨試液，預(yù)平衡15??min，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365?nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果如圖3所示。

2.2?含量測(cè)定[11-15]

2.2.1?色譜條件?色譜柱：Thermo?C18（5μm，250?mm×4.6?mm）;流動(dòng)相：甲醇-水（25∶75）;檢測(cè)波長(zhǎng)：250?nm;流速：1.0?mL/min;柱溫：25?℃;理論板數(shù)按葛根素計(jì)算應(yīng)不低于：3000。

2.2.2?制備葛根素對(duì)照品溶液?精密稱取葛根素對(duì)照品2.45?mg，置于25?mL容量瓶中，30%乙醇溶解，定容至刻度，制成每50?mL含4.92?mg的對(duì)照品溶液。

2.2.3?供試品溶液的制備?取適量樣品研成細(xì)粉，精密稱取1.0275?g，放于具塞錐形瓶中，精密移取并加入50?mL?30%乙醇溶液，密塞，準(zhǔn)確稱量并記錄，放入超聲儀中，30?min后，取出，放至室溫，稱量并記錄，用30%乙醇溶液補(bǔ)足超聲損失的重量，充分搖勻，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.2.4?陰性干擾試驗(yàn)?取不含葛根的其余藥材，按處方中藥味比例、工藝制成不含葛根的陰性樣品。再根據(jù)“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10?μL，分別注入高效液相色譜儀，設(shè)定方法，測(cè)定。根據(jù)液相色譜圖，陰性對(duì)照品在葛根素相對(duì)保留時(shí)間處未見色譜峰，陰性対照液色譜中則無此峰，結(jié)果顯示陰性樣品對(duì)該方法檢測(cè)幾乎無干擾，如圖4所示。

2.2.5?線性關(guān)系考察?分別精密吸取葛根素對(duì)照品溶液（C=0.098?mg/mL）1、2、3、4、5?mL，置于5?mL容量瓶中，以30%乙醇溶解并定容至刻度。分別精密吸取10?μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以葛根素的進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=4976.5X-40.04，r?=0.9998（n=6），結(jié)果表明，葛根素在0.196～0.980?μg范圍內(nèi)，峰面積線性關(guān)系良好，線性回歸曲線如圖5所示。

2.2.6?穩(wěn)定性試驗(yàn)?取批號(hào)為150112的葛芪平渴丸，制備供試品溶液，分別于?0?h、4?h及?8?h，精密吸取供試品溶液?10?μL，按擬定色譜條件，測(cè)定葛芪平渴丸中葛根素的峰面積，結(jié)果葛根素峰面積值的RSD%=1.51%。結(jié)果表明，葛芪平渴丸供試品溶液在?8?h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7?精密度試驗(yàn)?取供試品（批號(hào)：150112），按上述供試品制備方法制備供試品溶液，精密吸取10?μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，RSD%=0.29%。

2.2.8?重復(fù)性試驗(yàn)?取同一批號(hào)樣品（批號(hào)150112），按擬定的樣品制備方法制備6份供試品溶液，依法測(cè)定含量，RSD%=1.46%。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.2.9?回收率試驗(yàn)?按加樣回收法進(jìn)行試驗(yàn)，取樣品（批號(hào)150112）已知含量（葛根素3.1504?mg/g）的供試品適量，分別加入適量的葛根素對(duì)照品，按供試品制備方法制備，測(cè)定峰面積，以下式計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.2.10?樣品測(cè)定?取葛芪平渴丸三批樣品（批號(hào)分別為：150112、150114、150116），按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依照上述色譜條件測(cè)定其含量。結(jié)果見表2。

薄層色譜（TCL）葛根、黃連、薏苡仁特征斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)，陰性無干擾;葛根素含量在0.196～0.980?μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.9998，n=6），平均回收率為98.68%（RSD=0.68%，n=6）。

根據(jù)樣品測(cè)定結(jié)果，結(jié)合本制劑工藝及藥材含量，暫定本品每克含葛根以葛根素（C21H20O9）計(jì)，不得少于2.50?mg。

3?討論

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、50%乙醇、30%乙醇等不同溶劑提取效果[16-18]，結(jié)果顯示：甲醇、50%乙醇、30%乙醇超聲30?min，制備的供試品中葛根素的含量幾乎相同，依照優(yōu)化工藝及節(jié)省資源的原則，結(jié)合《中國(guó)藥典》2015年版一部，選用30%乙醇作為供試品的制備溶劑。

本實(shí)驗(yàn)還考察了15?min、30?min、45?min等不同超聲時(shí)長(zhǎng)的影響因素，結(jié)果顯示：超聲30?min制備的供試品中葛根素的含量最高，故確定30%乙醇超聲30?min作為制備葛芪平渴丸供試品溶液的方法。

本試驗(yàn)對(duì)處方中葛根、黃連、薏苡仁三味中藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別，對(duì)處方中君藥葛根指標(biāo)性成分葛根素進(jìn)行含量測(cè)定，從而建立該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。該試驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高，結(jié)果穩(wěn)定，可用于同種劑型中藥制劑的質(zhì)量檢測(cè)。目前大多數(shù)中藥制劑主要從薄層色譜定性鑒別和高效液相色譜法含量檢測(cè)兩方面入手，選取制劑處方中的部分藥材進(jìn)行檢測(cè)，制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

近年來，隨著中藥制劑的現(xiàn)代化發(fā)展及院內(nèi)制劑的開發(fā)，高效液相色譜法廣泛用于中藥材有效成分的含量檢測(cè)，但該方法并不是檢測(cè)藥品有效成分含量的唯一方法，氣相色譜法、液-質(zhì)聯(lián)用法、GC-MS聯(lián)用法、薄層色譜掃描法、核磁共振波普法等檢測(cè)方法逐漸運(yùn)用到中藥有效成分含量的檢測(cè)當(dāng)中，各種方法均具有其優(yōu)缺點(diǎn);中藥制劑主要為復(fù)方制劑，以辨證論治為基礎(chǔ)，根據(jù)中醫(yī)藥理論組方而成，大多數(shù)的院內(nèi)制劑，為臨床使用的經(jīng)驗(yàn)方，長(zhǎng)期臨床應(yīng)用療效顯著，不良反應(yīng)小，深受患者的好評(píng)，為了方便患者的服用及攜帶，中藥湯劑被逐漸改良為現(xiàn)代劑型，這就對(duì)中藥制劑的質(zhì)量要求也越來越高，由于中藥材成分復(fù)雜，檢測(cè)過程中易產(chǎn)生干擾，中成藥中有效成分的檢測(cè)更是如此，要求我們優(yōu)化供試品的制備方法，以節(jié)省資源、降低干擾成分、易操作為原則，采用不同的方法，檢測(cè)中藥制劑中有效成分及其含量范圍，對(duì)確保中藥制劑的質(zhì)量及穩(wěn)定性生產(chǎn)具有重要意義。

葛芪平渴丸是我院脾胃腎病科名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方，由葛根、黃連、薏苡仁、熟地黃等十四味中藥材組成，其作用是處方中各味中藥材共同作用的結(jié)果，且中藥有效成分復(fù)雜多樣，為了更進(jìn)一步研究發(fā)揮作用的有效成分及物質(zhì)基礎(chǔ)，在今后的試驗(yàn)研究中，應(yīng)從處方中各味中藥材入手，根據(jù)中醫(yī)藥理論及藥物之間的配伍關(guān)系，運(yùn)用多種檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行研究，從而制定更完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為臨床安全使用提供可靠的數(shù)據(jù)和試驗(yàn)研究資料。

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（收稿日期：2019-08-26?編輯：程鵬飛）