心脈隆注射液對ADP和花生四烯酸誘導(dǎo)血小板聚集的影響

韓亞娟 楊澤康 王夢蝶 沈磊

【摘?要】?目的：觀察心脈隆注射液（XML）對血小板聚集的影響。方法：使用血小板聚集儀觀察不同濃度的XML對二磷酸腺苷（ADP）和花生四烯酸（AA）誘導(dǎo)血小板聚集的影響，及是否誘導(dǎo)正常血小板聚集。結(jié)果：1?g/L的XML能顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，抑制率為7.8%;1?g/L和0.5?g/L的XML也明顯抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集，抑制率分別為57.7%和20.5%;所有濃度的XML均不能直接誘導(dǎo)血小板聚集。結(jié)論：XML能劑量依賴性地抑制不同誘導(dǎo)劑引起的血小板聚集，且對ADP誘導(dǎo)血小板聚集的抑制作用強(qiáng)于AA。

【關(guān)鍵詞】?心脈隆注射液;血小板聚集;二磷酸腺苷;花生四烯酸

【中圖分類號】R285.5?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】?A【文章編號】1007-8517（2019）21-0012-04

Influence?of?Xinmailong?Injection?on?ADP?and?Arachidonic?Acid-induced?Platelet?Aggregation

HAN?Yajuan1?YANG?Zekang1?WANG?Mengdie1?SHEN?Lei1，2*

1.College?of?Pharmacy?and?Chemistry，?Dali?University，?Dali?671000，?China;

2.Yunnan?Provincial?Key?Laboratory?of?Entomological?Biopharmaceutical?R&D，?Dali?671000，?China

Abstract：Objective?To?observe?the?influence?of?XML?on?platelet?aggregation.?Methods?The?influences?of?different?concentration?of?XML?on?ADP?and?Arachidonic?Acid?（AA）-induced?platelet?aggregation，?or?on?normal?function?of?platelet?were?evaluated?by?platelet?aggregation?analyzer.?Results?1?g/L?XML?significantly?inhibited?ADP-induced?platelet?aggregation?with?7.8%?inhibition?rate;?1g/L?and?0.5g/LXML?obviously?inhibited?AA-induced?platelet?aggregation?with?57.7%?and?20.5%?inhibition?rate，?respectively.?All?concentrations?of?XML?could?not?induce?platelet?aggregation.?Conclusion?XML?dose-dependently?inhibited?platelet?aggregation?induced?by?different?inducers，?and?the?inhibitory?effect?of?XML?on?platelet?aggregation?induced?by?ADP?was?stronger?than?that?induced?by?AA.

Keywords：XinMailong?Injection;?Platelet?Aggregation;?Adenosine?Diphosphate;?Arachidonic?Acid

異常血栓形成是很多心腦血管疾病的起因，如腦中風(fēng)、心肌缺血和動脈粥樣硬化[1]。在血栓形成的過程中，血管受損會激活血小板、引起其粘附和聚集并與纖維蛋白相互作用[2]。因此，血小板聚集是血栓形成的重要事件，其功能失調(diào)會促進(jìn)血栓性疾病的發(fā)展，而抗血小板聚集的藥物是治療心腦血管疾病的重要手段。

心脈隆注射液（Xinmailong?injection，XML）是用美洲大蠊提取的生物活性物質(zhì)制成，主要活性成分是一些小分子肽和氨基酸，為國家二類新藥，用于治療慢性心力衰竭，適應(yīng)癥為心功能的C期、D期，臨床上無明顯不良反應(yīng)，可安全使用[3]。近年來發(fā)現(xiàn)XML在心腦血管疾病中有廣泛的藥理活性，如對缺血性腦中風(fēng)急性期有一定的治療作用，減少腦梗死面積[4];對急性腦梗死合并慢性心力衰竭有輔助作用[5];減輕氧化應(yīng)激損傷血管平滑肌[6];抑制缺血缺氧后心肌細(xì)胞的凋亡[7];對抗動脈粥樣硬化，降低血清膽固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白[8]，還能保護(hù)受到動脈粥樣硬化損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞[9]。在這些疾病中均有血小板聚集的異常，而目前未見XML對血小板聚集作用的報道。因此，本實驗采用體外實驗考察XML對二磷酸腺苷（Adenosine?diphosphate，ADP）和花生四烯酸（Arachidonic?acid，AA）誘導(dǎo)血小板聚集的作用，并探討XML對正常血小板是否有影響，以此了解XML對心腦血管疾病的作用是否與血小板功能有關(guān)。

1?材料

1.1?實驗動物?SD大鼠購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，SPF級，雄性，體質(zhì)量280～320?g，許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.2?藥物與試劑?心脈隆注射液（批號：1703124，云南騰藥制藥股份有限公司）;一次性采血管（含129?mmol·L-1枸櫞酸鈉，批號：180906，瀏陽市三力醫(yī)用科技發(fā)展有限公司）;二磷酸腺苷（ADP，批號：716E022）和花生四烯酸（AA，批號：513B023）均購自北京索萊寶科技有限公司;替卡格雷（批號：C10061222，上海麥克林生物技術(shù)公司）;阿司匹林（批號：H172201，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.3?儀器?Agg?RAMTM型血小板聚集儀（美國Helena公司）

2?方法

2.1?XML對ADP誘導(dǎo)血小板聚集的作用?取SD大鼠，10%水合氯醛（3mL/kg）麻醉后，分離腹主動脈用含129?mmol/L枸櫞酸鈉的采血管取血，800?rpm，離心10?min后吸取上層的富含血小板血漿（PRP），下層血漿再經(jīng)3500?rpm，離心10?min后吸取上層的貧含血小板血漿（PPP）。用PPP調(diào)整PRP至血小板數(shù)目為200×109個/L。將PRP隨機(jī)分為4組：溶劑對照（生理鹽水）組，陽性藥替卡格雷（0.05?g/L）組，XML?1、0.5?g/L組。將各組藥物加入PRP中（37?℃）混勻孵育5?min，再加入ADP（10?μmoL/L）誘導(dǎo)血小板聚集，于血小板聚集儀中記錄血小板聚集曲線及血小板的最大聚集率，計算藥物對血小板聚集的抑制率?=?（溶劑對照組血小板最大聚集率-藥物組最大血小板聚集率）/溶劑對照組血小板最大聚集率×100%。

2.2?XML對AA誘導(dǎo)血小板聚集的作用?同上制備PRP和PPP，調(diào)整PRP至血小板數(shù)目為500×109個/L，同上對PRP分組，陽性藥為0.1?g/L的阿司匹林，誘導(dǎo)劑為AA（0.5?mmoL/L）。藥物孵育PRP后加入AA誘導(dǎo)血小板聚集，記錄血小板的最大聚集率，計算藥物對血小板聚集的抑制率。

2.3?XML對正常血小板的作用?制備PRP和PPP，調(diào)整PRP至血小板數(shù)目為200×109個/L，將PRP隨機(jī)分為4組：溶劑對照（生理鹽水）組，XML高、中、低濃度組（1、0.5、0.25?g/L）組。用藥物孵育PRP后，直接記錄血小板聚集曲線和血小板最大聚集率，觀察XML對正常血小板的作用。

2.4?統(tǒng)計學(xué)處理?使用SPSS?13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)比較使用one-ANOVA分析，并檢驗方差是否齊性，若方差齊性，使用LSD法比較兩組間差異，若方差不齊，使用Dunnett?T3法比較兩組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3?結(jié)果

3.1?XML抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集?與溶劑對照組相比，1?g/L的XML能顯著性抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），抑制率為7.8%;而0.5g/L的XML作用不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。陽性藥替卡格雷抑制ADP致血小板聚集作用非常明顯（P<0.01），抑制率高達(dá)77.4%。結(jié)果見圖1和表1。

3.2?XML抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集?XML抑制AA誘導(dǎo)血小板聚集的作用要優(yōu)于抑制ADP對血小板聚集的誘導(dǎo)作用。與溶劑對照組相比，1?g/L和0.5?g/L的XML均能顯著性抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，P<0.01），抑制率分別達(dá)到為57.7%和20.5%。與1?g/L的XML相比，陽性藥阿司匹林也能明顯抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集（P<0.01），抑制率為57.4%。結(jié)果見圖2和表2。

3.3?XML誘導(dǎo)血小板聚集?由圖3、表3可知，直接加入XML不能誘導(dǎo)血小板聚集。與溶劑對照組相比，加入1?g/L、0.5?g/L和0.25?g/L的XML后，血小板的最大聚集率均無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

4?討論

血管損傷后，很多活性物質(zhì)從內(nèi)皮細(xì)胞釋放，趨化血小板粘附于受損部位，并與相應(yīng)的表面受體結(jié)合活化血小板?；罨难“遽尫艃Υ娴奈镔|(zhì)，如ADP、血清素、血小板活化因子、AA誘導(dǎo)的血栓素A2（thromboxane?A2，TXA2）等，啟動并促進(jìn)血小板聚集。誘導(dǎo)血小板聚集的共同通路為引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加來激活血小板膜上的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa[10-13]。本實驗中，心脈隆注射液（XML）對ADP和AA誘導(dǎo)的血小板聚集均有濃度依賴性的抑制作用，而對AA介導(dǎo)途徑的作用明顯強(qiáng)于ADP介導(dǎo)途徑，這可能與XML調(diào)節(jié)AA途徑中的幾個重要因子有關(guān)。有研究表明，XML能對抗動脈粥樣硬化對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，升高動脈粥樣硬化大鼠的一氧化氮（Nitric?oxide，NO）和前列環(huán)素（Prostaglandin?I2，PGI2）水平，并降低內(nèi)皮素（Endothelin，ET）水平，能減少血栓素B2（thromboxane?B2，TXB2）水平但無統(tǒng)計學(xué)差異[9]。由于NO和PGI2可抑制血小板聚集，而ET和TXA2（TXA2半衰期很短，其含量用下游產(chǎn)物TXB2表示）促進(jìn)血小板聚集，XML對這些因子的作用均有利于其抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集。另外，在ADP誘導(dǎo)血小板聚集途徑中，ADP激活血小板表面ADP受體后，使細(xì)胞內(nèi)cAMP降低并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，啟動血小板聚集[10]。目前未見XML對ADP和cAMP作用的報道，而有研究表明XML能增加心衰心肌細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流[14]。盡管XML對血小板的細(xì)胞內(nèi)Ca2+作用可能不同于對心肌細(xì)胞的作用，這種XML對Ca2+作用也可能與XML對ADP誘導(dǎo)血小板聚集作用較弱有關(guān)。實驗也考察了XML對正常血小板的作用，發(fā)現(xiàn)所有濃度的XML均不會誘導(dǎo)血小板聚集。

目前，XML在臨床的主要適應(yīng)癥為心功能C期與D期、紐約心臟病分級Ⅱ-Ⅳ級的心衰患者，可單獨使用，也可以合用洋地黃、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、利尿劑、β-受體阻滯劑等。另外，XML對心腦血管缺血性疾病顯示出一定的療效，如急性心肌梗死[15]和急性腦梗死合并心力衰竭[5]。對這些缺血性疾病的治療過程中，在使用常規(guī)的抗血小板藥、抗凝藥和調(diào)脂藥的基礎(chǔ)上使用XML后發(fā)現(xiàn)能縮小梗死范圍[15]，減輕神經(jīng)功能缺損[5]，除了XML具有對抗動脈粥樣硬化[9]、抑制過度自由基氧化[16]、抗心律失常[17]、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖[18]，并分化為神經(jīng)元的作用外，本實驗結(jié)果也表明XML對異?；罨难“骞δ芤灿凶饔?，其本身能直接抑制血小板聚集，改善血液流變學(xué)。實驗提示在合用抗血小板藥物時，XML更適合合用抑制ADP途徑的藥物（如氯吡格雷）優(yōu)于合用抑制AA途徑的藥物（如阿司匹林），這是因為藥物聯(lián)合使用通?？紤]合用不同機(jī)制的藥物，而XML主要抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集，未見血栓傾向的心腦血管疾病使用XML也不會影響正常的血小板功能。綜上所述，實驗為XML治療缺血性心腦血管疾病提供了可能的一種機(jī)制。

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（收稿日期：2019-08-22?編輯：程鵬飛）