響應(yīng)面法優(yōu)化白背毛木耳子實體多糖的酶法提取工藝

黃藝寧，陳國平，柯麗娜

（1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000；2.漳州市農(nóng)業(yè)局種植業(yè)管理站，福建 漳州 363000；3.漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 漳州 363005）

白背毛木耳是一種食藥兼用的食用菌，素有“樹上海蜇皮”之美稱，它不僅營養(yǎng)豐富，且藥用價值高，其多糖具有抗氧化[1]、抗腫瘤[2-3]等功能。白背毛木耳多糖的提取是其應(yīng)用的基礎(chǔ)，所以高效的提取技術(shù)是白背毛木耳研究熱點之一。目前毛木耳子實體多糖提取的方法有熱水浸提法、乙醇浸提法、超聲波熱水浸提法以及酸堿浸提法[4]，其它的方法則未見報道。酶法提取主要是通過破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)后再進(jìn)行提取，具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高的特點，且酶的專一性可以避免對底物物質(zhì)的破壞[5]。目前酶法提取已經(jīng)在研究和生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，使用酶法進(jìn)行降解后提取能減少提取溶劑的用量、縮短提取時間以及提高提取率[6-8]。目前酶法提取作為一種高效安全的提取方式被運用于各類生物活性物質(zhì)，且已經(jīng)應(yīng)用于多個菌類多糖的提取[9-11]，但至今未應(yīng)用于白背毛木耳子實體多糖的提取。白背毛木耳子實體纖維含量高，胞內(nèi)多糖不易溶出，以纖維素酶處理白背毛木耳子實體能降解毛木耳細(xì)胞壁，促進(jìn)胞內(nèi)的多糖溶出，能縮短提取時間和提高得率。本文通過對酶法提取工藝條件的摸索將提高多糖得率，為白背毛木耳多糖的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白背毛木耳43-28，由漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。纖維素酶(20 000 U/g)，食品級，南寧龐博生物工程有限公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱KZX-9070 MBE，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；高速多功能粉碎機Q-250B，上海冰都電器有限公司；電子天平BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；JH恒溫水浴鍋，上海佳航儀器儀表有限公司；紫外可見分光光度計UV-1800PC-DS2，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 白背毛木耳多糖的提取

含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%白背毛木耳粉碎過篩后，稱4 g樣品使用纖維素酶浸提，過濾，濾液用sevage法除蛋白，收集濾液進(jìn)行多糖含量測定。

1.2.2 多糖得率的計算[12]

多糖得率采用白背毛木耳干品中提取多糖總量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。采用苯酚-硫酸法測定總糖，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，具體算法如下：

式中：0.9為單糖折算為葡萄糖的換算系數(shù)。

1.2.3 單因素分析

1、料液比對白背毛木耳子實體多糖得率的影響。在酶用量為3 000 U/g、pH值為5.0、溫度為50℃、提取時間為180 min的條件下，考察料液比（g/mL）分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20、1∶30、1∶40、1∶50對白背毛木耳多糖得率的影響。

2、酶用量對白背毛木耳子實體多糖得率的影響。在料液比為1 g：30 mL、pH值為5.0、溫度為50℃、提取時間為180 min的條件下，考察不同酶用量（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g）對白背毛木耳多糖得率的影響。

3、pH值對白背毛木耳子實體多糖得率的影響。在料液比為1 g：30 mL、酶用量為3 000 U/g、溫度為50℃、提取時間為180 min的條件下，考察不同pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）對白背毛木耳多糖得率的影響。

4、提取溫度對白背毛木耳子實體多糖得率的影響。在料液比為1 g：30 mL、酶用量為3 000 U/g、pH值為5.0、提取時間為180 min的條件下，考察不同溫度（0、45、50、55、60、65℃）對白背毛木耳多糖得率的影響。

5、提取時間對白背毛木耳子實體多糖得率的影響。在料液比為1g：30 mL、酶用量為3 000 U/g、pH值為5.0、提取溫度為50℃的條件下，考察不同提取時間（30、60、90、120、150、180 min）對白背毛木耳多糖提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶法提取工藝

1、響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶法提取工藝試驗設(shè)計。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酶用量、提取pH、提取溫度、提取時間4個因素為變量，以白背毛木耳子實體多糖的得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken法對多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最佳的提取效果。根據(jù)單因素試驗結(jié)果制定因素組合設(shè)計編碼水平，見表1。

表1 多糖得率Box-Behnken中心組合設(shè)計編碼水平

2、響應(yīng)曲面法優(yōu)化工藝參數(shù)驗證。以優(yōu)化后的最佳工藝條件進(jìn)行平行提取3次，與模型預(yù)測值進(jìn)行比較。將酶法提取工藝與微波輔助提取工藝[1]進(jìn)行比較，評價該方法的優(yōu)劣。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析

2.1.1 料液比對白背毛木耳子實體多糖得率的影響

由圖1可知，料液比大于1 g∶30 mL時，白背毛木耳子實體多糖的得率隨著提取溶劑的增加而顯著增大。當(dāng)料液比小于1 g∶30 mL時，白背毛木耳子實體多糖的提取率并沒有隨著提取溶劑比例的增加而顯著提升，這是由于在設(shè)定的條件下當(dāng)料液為1 g∶30 mL時多糖已經(jīng)基本溶于溶劑中。為了減輕后續(xù)的濃縮步驟的工作量考慮，將提取時的料液比定為1 g∶30 mL。

圖1 料液比對多糖得率的影響

2.1.2 酶用量對白背毛木耳子實體多糖得率的影響

由圖2可知，在設(shè)定的條件下，酶用量在小于3 000 U/g時，隨著用量的增加得率有顯著的提升。當(dāng)大于3 000 U/g時，得率的提升不明顯。這是因為在設(shè)定的條件下當(dāng)酶用量達(dá)到3 000 U/g時已經(jīng)能夠使胞內(nèi)的多糖完全溶出。因此，酶用量宜在3 000 U/g。

圖2 酶用量對多糖得率的影響

2.1.3 pH值對白背毛木耳子實體多糖得率的影響

由圖3可知，在設(shè)定的條件下，當(dāng)pH值為5.0時得率最大。纖維素酶酶解需要適合的pH值，當(dāng)大于或者小于最佳pH時得率隨之減少。因此，提取時的pH值宜設(shè)定在5。

圖3 pH值對多糖得率的影響

2.1.4 提取溫度對白背毛木耳子實體多糖得率的影響

由圖4可知，當(dāng)提取溫度低于50℃時，隨著溫度的升高白背毛木耳子實體的得率也顯著增加。而當(dāng)溫度超過50℃時，多糖的得率隨著溫度的升高有所下降。這是由于過高的溫度容易引起酶變性而使酶失活導(dǎo)致的。因此，提取溫度選擇在50℃左右。

圖4 提取溫度對多糖得率的影響

2.1.5 提取時間對白背毛木耳子實體多糖得率的影響

由圖5可知，白背毛木耳多糖得率是隨著提取時間的延長而提高。而提取時間在30～120 min內(nèi)，提取率是隨著時間的延長而顯著提高。而提取時間大于120 min時，隨著時間的延長，提取率略有提高。所以，提取時間宜選在120 min左右。

圖5 提取時間對多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶法提取工藝

2.2.1 響應(yīng)曲面試驗結(jié)果

根據(jù)試驗設(shè)計，以白背毛木耳子實體多糖得率(Y)為響應(yīng)值，酶用量(A)、pH(B)、提取溫度(℃)、提取時間(D)為變量，經(jīng)過Design-Expert10軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗結(jié)果和分析如表2、表3所示。

表2 得率影響因素的Box-Behnken試驗方案及結(jié)果

續(xù)表2

表3 不同因素對多糖得率影響的方差分析

運用Design-Expert10軟件對表2的試驗結(jié)果進(jìn)行擬合得到白背毛木耳子實體多糖得率影響因素的回歸方程：提取率=15.24+0.42*A-0.13*B+0.22*C+0.38*D-0.040*AB++0.068*AC-0.095*AD+0.00025*BC-0.098*BD-0.43*CD-0.25*A2-0.51*B2-0.87*C2-0.32*D2。白背毛木耳子實體多糖得率二次多項回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

由表3的方差分析數(shù)據(jù)可知，應(yīng)用Design-Expert10軟件得到的數(shù)據(jù)模型是極顯著（P＜0.000 01）,而失擬項不顯著（P=0.0612＞0.05），這說明本試驗得到的數(shù)據(jù)模型的回歸方程擬合度良好，試驗結(jié)果可靠。

2.2.2 響應(yīng)面分析

利用數(shù)據(jù)模型做的響應(yīng)曲面可以反映因素或因素之間的交互作用對白背毛木耳子實體多糖得率影響的強弱，響應(yīng)曲面的陡峭程度越大，則對提取率的影響也越大。由圖6可知，在響應(yīng)面試驗設(shè)計范圍內(nèi)，各個因素中酶解溫度對白背毛木耳子實體多糖提取率的影響最大，提取時間的影響次之，酶用量影響第三，pH的影響均較?。唤换プ饔弥?，pH值與提取溫度的交互作用對白背毛木耳子實體多糖的提取率影響最大，提取時間與提取溫度的交互作用的影響次之，pH值與提取時間的交互作用的影響最小，這與表3的方差分析結(jié)果一致。

圖6 基于響應(yīng)曲面法不同因素對多糖提取率的影響

2.2.3 酶法提取白背毛木耳子實體多糖的最佳工藝

經(jīng)過Design-Expert10軟件分析，得到酶法提取白背毛木耳子實體多糖的最佳工藝條件為：纖維素酶3 774 U/g、pH值為4.9、提取溫度50.2℃、提取時間135 min。在該工藝條件下白背毛木耳子實體多糖的理論得率為15.52%。這說明了利用Box-Behnken建立的模型是合理的。采用響應(yīng)面分析得到的最佳工藝條件進(jìn)行白背毛木耳子實體多糖的提取，提取率為15.47%，與模型預(yù)測的理論值15.52%僅有0.323%的誤差。這說明該模型得到的結(jié)果是可靠的。

2.2.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化工藝參數(shù)驗證

如圖7所示，用得到的酶法提取的最佳工藝條件進(jìn)行提取的得率為15.47%，比微波輔助提取白背毛木耳多糖[1]的得率14.03%要高10.26%。這說明用酶法提取白背毛木耳子實體多糖能提高多糖的得率。

圖7 酶法與微波法提取多糖對比

3 討論與結(jié)論

通過響應(yīng)面法對酶法提取白背毛木耳子實體多糖進(jìn)行建模分析，優(yōu)化酶法提取白背毛木耳子實體多糖的工藝提取條件。結(jié)果表明：在纖維素酶用量3 774 U/g、提取溫度50.2℃、pH=4.9、提取時間135 min的條件下，白背毛木耳子實體多糖的得率為15.47%，與模型預(yù)測值15.52%的相對誤差僅為0.323%。通過與微波輔助提取法的對比，得率提高了10.26%。在對比的過程中，使用微波輔助法的多糖提取率與楊申明[1]的提取率有較大的差別，這可能是由于白背毛木耳品種不一樣的原因。在本研究中雖然確定了用酶法提取白背毛木耳子實體多糖的最佳工藝，獲得了較高的得率，但對于提取到的多糖功能還未進(jìn)行驗證，這需要后續(xù)進(jìn)一步的深入工作。