大孔吸附樹(shù)脂分離純化了哥王中西瑞香素的工藝*

賴紅芳，潘立衛(wèi)，黃秀香，覃光全

(河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，宜州 546300)

了哥王(WikstroemiaindicaLinn，別名Indianstringbush)屬瑞香科蕘花屬植物[1-2]，有黃皮子、南嶺蕘花、小金腰帶等別稱。其性味苦、辛微溫、毒性較大，有清熱解毒、消腫散結(jié)、逐水散瘀等功能，具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒等多種藥理作用[3]。人們常用了哥王與其他中草藥配伍，用于治療坐骨神經(jīng)痛、淋巴結(jié)腫大、軟組織損傷、帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛、風(fēng)濕痛、惡性腫瘤、肝硬化等癥[4]，因主治男性病癥療效好，有利于男性，因此有了哥王之稱。目前，了哥王檢測(cè)出多種化學(xué)成分，分別是山萘酚、牛蒡苷元、南蕘酚、松脂酚、芫花素[5]、西瑞香素[6]等。其中西瑞香素為香豆素類化合物，別稱了哥王素，是了哥王藥材中主要成分，具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤[7-8]等藥理作用，也是民間藥物穿王消炎片、了哥王片等主要成分和相關(guān)藥品質(zhì)量的主要考察指標(biāo)成分之一[9]。

大孔吸附樹(shù)脂不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑，具有化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)穩(wěn)定性高、吸附速度快、選擇性好、比表面積大和吸附量大等優(yōu)點(diǎn)[10]，是一類具有很好吸附效果的有機(jī)高分子聚合物。近年來(lái)，大孔吸附樹(shù)脂在分離純化多酚、黃酮類多種活性物質(zhì)的應(yīng)用越來(lái)越普遍[11]。目前對(duì)了哥王中西瑞香素的研究主要是分離純化方法、結(jié)構(gòu)及含量測(cè)定等[12-13]，關(guān)于其分離純化工藝筆者未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選用8種不同型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂，利用靜態(tài)吸附從8種不同型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂中篩選出一種吸附-解吸效果最好的大孔吸附樹(shù)脂，通過(guò)優(yōu)化吸附與解吸純化工藝，考察大孔吸附樹(shù)脂對(duì)了哥王中西瑞香素的純化效果的影響，為開(kāi)發(fā)以西瑞香素為主的藥品及功能性食品提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(四元泵，VWD 檢測(cè)器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器)、Agilent 1260 series色譜工作站、Agilent 8453型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫公司)；KQ250DE超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；AUW220D型天平(日本島津公司，感量：0.01 mg)；MilliporeD-Q3超純水機(jī)(美國(guó)密理博公司)。

1.2藥材與試劑 了哥王購(gòu)于玉林中草藥市場(chǎng)，經(jīng)河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院鄧晰朝副教授鑒定為了哥王(WikstroemiaindicaLinn)根莖。西瑞香素標(biāo)準(zhǔn)品(陜西華昱生物科技有限公司，批號(hào)：51118，含量≥99.5%)；色譜純甲醇(美國(guó)Tedia公司)；大孔吸附樹(shù)脂HPD600、HPD450、D4020、AB-8、DM130、HP20、D101、NKA-9(鄭州華溢科技新材料股份有限公司)；無(wú)水乙醇及磷酸為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1西瑞香素的測(cè)定條件 高效液相色譜儀：色譜柱為Kramasil C18；流動(dòng)相為甲醇-0.1 %磷酸溶液(55：45)；流速為0.6 mL·min-1；紫外光檢測(cè)波長(zhǎng)為346 nm；柱溫為28 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取西瑞香素標(biāo)準(zhǔn)品3 mg于小燒杯中，加入70%乙醇15 mL超聲，使之溶解，然后轉(zhuǎn)移到50 mL量瓶中，再用70%乙醇定容，搖勻，即得60 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。分別用移液管移取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，體積為0.5，1.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mL，置于比色管中，加70%乙醇定容至10 mL，搖勻，過(guò)孔徑0.45 μm有機(jī)膜，在“2.1”項(xiàng)條件下測(cè)得不同濃度西瑞香素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液的峰面積。以西瑞香素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3了哥王中西瑞香素超聲提取 將處理好的了哥王根莖切成片，粉碎后保存，精密稱量了哥王粉末10 g置于250 mL錐形瓶中，以料液比為1：20，提取溫度為40 ℃，功率為90 W，提取溶劑為70%乙醇，超聲時(shí)間為0.4 h，超聲提取2次，合并2次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除部分溶劑，得了哥王中西瑞香素粗提液，冷藏備用。

2.48種大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸的篩選

2.4.1靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 分別稱取8種大孔樹(shù)脂樹(shù)脂2.0 g于250 mL錐形瓶中，加入濃度為46.3 μg·mL-1樣品溶液25 mL，常溫，放在搖振床上振蕩24 h，轉(zhuǎn)速180 r·min-1，濾過(guò)，濾液定容至25 mL，溶液過(guò)孔徑0.45 μm有機(jī)膜濾過(guò)，用“2.2”項(xiàng)的條件測(cè)定濾液中西瑞香素的峰面積，代入回歸方程計(jì)算西瑞香素的質(zhì)量濃度，根據(jù)以下公式(1)計(jì)算大孔樹(shù)脂吸附率，對(duì)大孔樹(shù)脂的吸附性能進(jìn)行篩選。

公式(1)：A為吸附率(%)；C0為西瑞香素的起始質(zhì)量濃度(mg ·mL-1)；V0為起始體積(mL)；C1為吸附后西瑞香素的質(zhì)量濃度(mg ·mL-1)；V1為吸附溶液體積(mL)。

2.4.2靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn) 將充分吸附后的大孔樹(shù)脂用純化水沖洗至大孔樹(shù)脂表面無(wú)提取殘留液，然后抽干，再加入70%乙醇溶液25 mL，常溫，置于搖床上振蕩24 h，轉(zhuǎn)速180 r·min-1，充分解吸后過(guò)濾，濾液定容至25 mL，溶液過(guò)孔徑0.45 μm有機(jī)膜，用“2.2”項(xiàng)條件測(cè)定濾液中西瑞香素的峰面積，代入回歸方程計(jì)算西瑞香素的質(zhì)量濃度，按公式(2) 計(jì)算解吸率，對(duì)大孔樹(shù)脂解吸能力進(jìn)行篩選。

公式(2)中：B為解吸率(%)；C0為西瑞香素的起始質(zhì)量濃度(mg ·mL-1)；V0為起始體積(mL)；C1為吸附后西瑞香素的質(zhì)量濃度(mg ·mL-1)；V1為吸附溶液體積(mL) ；C2為解吸液中西瑞香素的質(zhì)量濃度(mg ·mL-1)；V2為吸附溶液體積(mL)。

富集回收率=吸附率×解吸率。

2.5大孔樹(shù)脂HPD600對(duì)了哥王中西瑞香素純化工藝的吸附優(yōu)化

2.5.1上樣質(zhì)量濃度的考察 稱取5份預(yù)先處理好的大孔樹(shù)脂HPD600 3.0 g，濕法裝柱。將西瑞香素質(zhì)量濃度分別為39.3，48，61.7，86.4，144 μg·mL-1的了哥王粗提取液15 mL，以相同體積流速通過(guò)大孔樹(shù)脂樹(shù)脂柱滴下，完全吸附后，沖洗干凈，定容，溶液經(jīng)孔徑0.45 μm有機(jī)膜濾過(guò)，用“2.2”項(xiàng)的條件測(cè)定后計(jì)算吸附率。

2.5.2上樣體積流速的考察 稱取5份預(yù)先處理好的大孔樹(shù)脂HPD600 3.0 g，濕法裝柱。選取西瑞香素質(zhì)量濃度約90 μg·mL-1的了哥王粗提取液30 mL上柱，以不同體積流速0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL·min-1通過(guò)大孔樹(shù)脂滴下，分別收集流出液，沖洗干凈，定容，溶液經(jīng)孔徑0.45 μm有機(jī)膜濾過(guò)，用“2.2”項(xiàng)的條件測(cè)定后計(jì)算吸附率。

2.5.3上樣體積的考察 稱取預(yù)先處理好的大孔吸附樹(shù)脂HPD600 3.0 g，濕法裝柱，選取西瑞香素約為90 μg·mL-1的了哥王粗提取液90 mL，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。樣液加入流速為1.5 mL·min-1，通過(guò)大孔樹(shù)脂滴下，分段收集流出液，流速同樣為1.5 mL·min-1，每份5 mL，收集18份。溶液經(jīng)過(guò)孔徑0.45 μm有機(jī)膜，用“2.2”項(xiàng)條件測(cè)定后計(jì)算吸附率。

2.6大孔吸附樹(shù)脂HPD600對(duì)了哥王中西瑞香素純化工藝的解吸優(yōu)化

2.6.1洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的考察 稱取5份處理的大孔吸附樹(shù)脂HPD600 3.0 g，濕法裝柱，量取西瑞香素濃度約90 μg·mL-1樣品液45 mL，流速1.5 mL·min-1進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，吸附完全之后，先用水10 mL沖洗，再分別以50%，60%，70%，80%，90%乙醇各30 mL進(jìn)行洗脫，收集溶液，定容，溶液過(guò)孔徑0.45 μm有機(jī)膜濾過(guò)，用“2.2”項(xiàng)條件測(cè)定后計(jì)算解吸率。

2.6.2洗脫劑體積流速的考察 稱取5份處理好的大孔吸附樹(shù)脂HPD600 3.0 g，濕法裝柱，取西瑞香素濃度約為90 μg·mL-1的樣品液45 mL，流速為1.5 mL·min-1進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，吸附完全之后，先用水10 mL沖洗，再用90%乙醇10 mL分別以0.5，1.5，2.5，3.5，4.5 mL·min-1流速滴下，收集溶液，定容，溶液經(jīng)孔徑0.45 μm有機(jī)膜濾過(guò)，用“2.2”項(xiàng)條件測(cè)定后計(jì)算解吸率。

2.6.3洗脫劑用量的考察 稱取預(yù)先處理好的大孔樹(shù)脂HPD600 3.0 g，濕法裝柱，取樣品液40 mL，含西瑞香素90 μg·mL-1，流速為1.5 mL·min-1，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，吸附完全后，先用水10 mL沖洗，用90%乙醇以1.5 mL·min-1流速進(jìn)行解吸，每5 mL 流出液為1管收集，直到流出液接近無(wú)色時(shí)，終止收集。溶液過(guò)孔徑0.45 μm有機(jī)膜濾過(guò)，用“2.2”項(xiàng)條件測(cè)定后計(jì)算解吸率。

2.7驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.7.1驗(yàn)證吸附實(shí)驗(yàn) 稱取5份預(yù)先處理好的大孔樹(shù)脂HPD600 3.0 g，濕法裝柱， 按吸附單因素實(shí)驗(yàn)找出的最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，吸附完全后，先用水10 mL沖洗，收集溶液，溶液過(guò)孔徑0.45 μm有機(jī)膜濾過(guò)，用“2.2”項(xiàng)的條件測(cè)定后計(jì)算吸附率。

2.7.2驗(yàn)證解吸實(shí)驗(yàn) 采用“2.7.1”項(xiàng)抽干的大孔樹(shù)脂按解吸單因素找出的最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行洗脫，收集其溶液，溶液過(guò)孔徑0.45 μm有機(jī)膜濾過(guò)，用“2.2”項(xiàng)的條件測(cè)定后計(jì)算解吸率及富集回收率。合并洗脫液，制成了哥王西瑞香素粉末，計(jì)算純度。

P(%)=C2V2/M×100 (3)

式中：P為樣品中西瑞香素的純度；C2為洗脫液中西瑞香素濃度(mg ·mL-1)；V2為洗脫液體積(mL)；M為西瑞香素樣品的質(zhì)量(干重，mg)[14]。

3 結(jié)果

3.1西瑞香素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品高效液相色譜圖 對(duì)西瑞香素標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖及了哥王樣品溶液的高效液相色譜圖進(jìn)行分析，西瑞香素出峰時(shí)間為4.9 min，其峰型對(duì)稱，分離效果好，結(jié)果見(jiàn)圖1。

A.西瑞香素標(biāo)準(zhǔn)品；B.了哥王提取液

圖1西瑞香素標(biāo)準(zhǔn)品和了哥王提取液的高效液相色譜圖

A.dephnoretin standard;B.WikstroemiaindicaLinn extraction solution

Fig.1HPLCchromatogramofdephnoretinstandardandWikstroemiaindicaLinnextractionsolution

3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以西瑞香素質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果回歸方程為A=61.811X-74.102，R2=0.999 7，A是峰面積，X是西瑞香素質(zhì)量濃度，單位為μg·mL-1。

3.38種大孔樹(shù)脂靜態(tài)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，大孔樹(shù)脂HPD600的吸附率與解吸率在這些樹(shù)脂中最佳，所以選擇大孔樹(shù)脂HPD600進(jìn)行下一步動(dòng)態(tài)純化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表18種大孔樹(shù)脂對(duì)西瑞香素吸附率和解吸率

Tab.1Adsorptionrateanddesorptionrateofeightmacroporousresinsfordephnoretin

樹(shù)脂種類樹(shù)脂類型吸附率解吸率%D101非極性44.445.5HP20非極性44.946.0HPD450弱極性44.049.2NKA-9極性43.246.6HPD600極性48.750.6D4020非極性46.845.2DM130弱極性44.322.3AB-8弱極性37.344.6

3.4大孔樹(shù)脂HPD600對(duì)了哥王中西瑞香素純化工藝的吸附優(yōu)化

3.4.1上樣質(zhì)量濃度的考察 以“2.5.1”項(xiàng)測(cè)得西瑞香素的峰面積代入回歸方程計(jì)算西瑞香素質(zhì)量濃度，并計(jì)算該大孔樹(shù)脂的吸附率，結(jié)果吸附率分別為70.4%，79.6%，89.8%，96.3%，96.7%，見(jiàn)圖2。

圖2 上樣濃度對(duì)樹(shù)脂吸附效果的影響

Fig.2Impactofdifferentinitialconcentrateiononadsorptioneffectofresin

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)濃度>86.4 μg·mL-1時(shí)吸附率基本沒(méi)有變化，由于濃度過(guò)高吸收雜質(zhì)過(guò)多，雜質(zhì)會(huì)覆蓋在大孔樹(shù)脂表面，會(huì)影響純化效果；濃度過(guò)低不利于吸附，吸附率低，因此上樣濃度約90 μg·mL-1，可為工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

3.4.2上樣體積流速的考察 以“2.5.2”項(xiàng)測(cè)得西瑞香素的峰面積代入回歸方程式計(jì)算西瑞香素的質(zhì)量濃度，并計(jì)算相應(yīng)吸附率，結(jié)果吸附率分別為97.0%，97.2%，96.4%，95.8%，93.7%，見(jiàn)圖3。

圖3 不同吸附流速對(duì)樹(shù)脂吸附效果的影響

Fig.3Impactofdifferentadsorptionvelocityontheadsorptioneffectofresin

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著上樣溶液流速逐漸增大，大孔樹(shù)脂HPD600對(duì)了哥王中西瑞香素的動(dòng)態(tài)吸附率逐漸下降，由于上樣溶液的流速越小，與大孔樹(shù)脂接觸面積越大，大孔樹(shù)脂表面的吸附效果越好，流速加快，泄漏量也跟著加大，從而影響吸附效果。在上樣溶液流速分別為0.5，1.0和1.5 mL·min-1時(shí)，大孔樹(shù)脂對(duì)樣液中西瑞香素的吸附率相差不大，但過(guò)柱速率卻相差1倍，所以通過(guò)綜合考慮過(guò)柱速率與吸附率，選擇上樣樣液流速為1.5 mL·min-1。

3.4.3上樣體積的考察 以“2.5.3”項(xiàng)測(cè)得西瑞香素的峰面積代入回歸方程式計(jì)算每管(5 mL)西瑞香素的濃度，結(jié)果1～18號(hào)管西瑞香素的濃度分別為0.0，2.0，2.4，2.2，2.2，2.4，3.6，5.0，8.8，29.4，52.9，62.4，71.5，79.4，82.8，87.5，88.0，88.1 μg·mL-1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)流出液收集到第9 個(gè)5 mL 的時(shí)候，西瑞香素溶液開(kāi)始大量泄漏，當(dāng)西瑞香素濃度約為90 μg·mL-1、樣品液為45 mL時(shí)，基本達(dá)到飽和，建議上樣液體體積為45 mL。

當(dāng)了哥王中西瑞香素濃度約為90 μg·mL-1，上樣體積為45 mL，上樣流速為1.5 mL·min-1時(shí)，大孔樹(shù)脂HPD600對(duì)了哥王中西瑞香素吸附最好。

3.5大孔吸附樹(shù)脂HPD600對(duì)了哥王中西瑞香素純化工藝的解吸優(yōu)化

3.5.1洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的考察 以“2.6.1”項(xiàng)測(cè)得西瑞香素的峰面積代入回歸方程式計(jì)算每管西瑞香素的質(zhì)量濃度。結(jié)果解吸率分別為23.3%，50.4%，80.4%，92.9%，97.7%，見(jiàn)圖4。

圖4 不同濃度乙醇的洗脫效果

Fig.4Elutioneffectofdifferentconcentrationofethanol

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著乙醇濃度逐漸增大，解吸率也隨著逐漸增大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)90%時(shí)，解吸了哥王中西瑞香素效果比較好，如果用無(wú)水乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫下來(lái)雜質(zhì)隨之增多，影響純化效果。因此選用90%乙醇對(duì)了哥王中西瑞香素進(jìn)行洗脫。

3.5.2洗脫劑體積流速的考察 以 “2.6.2”項(xiàng)測(cè)得西瑞香素的峰面積代入回歸方程式計(jì)算西瑞香素的濃度。結(jié)果解吸率分別為57.5%，58.1%，50.3%，47.2%，39.6%，見(jiàn)圖5。

圖5 不同解析流速對(duì)洗脫效果的影響

Fig.5Impactofdifferentdesorptionvelocityondesorptioneffect

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，90%乙醇體積流速越快，解吸率越低。上樣樣液流速分別為0.5和1.5 mL·min-1時(shí)，大孔樹(shù)脂對(duì)樣液中西瑞香素的解吸率相差不大，但通過(guò)柱速率卻相差1倍，通過(guò)綜合考慮過(guò)柱速率與解吸率，因此選擇1.5 mL·min-1為洗脫劑體積流速。

3.5.3洗脫劑用量的考察 以 “2.6.3”項(xiàng)測(cè)得西瑞香素的峰面積代入回歸方程式計(jì)算出每管(5 mL)西瑞香素的質(zhì)量濃度，當(dāng)測(cè)到濃度接近于零時(shí)，停止。1～12號(hào)管中西瑞香素的濃度分別為0.0，259.7，192.8，140.6，78.4，41.5，13.6，10.7，7.0，4.6，4.3，4.1 μg·mL-1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)?shù)?管以后，洗脫液中西瑞香素含量很少，所以應(yīng)加90%乙醇洗脫劑體積為30 mL。

當(dāng)洗脫了哥王中西瑞香素時(shí)，90%乙醇為洗脫劑，洗脫體積為30 mL，洗脫流速為1.5 mL·min-1時(shí)，對(duì)吸附后了哥王中西瑞香素的大孔樹(shù)脂HPD600解吸最好。

3.6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按吸附最佳條件即：西瑞香素濃度約為90 μg·mL-1，上樣體積為45 mL，上樣流速為1.5 mL·min-1時(shí)重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，以“2.7.1”項(xiàng)測(cè)得西瑞香素的峰面積代入回歸方程式計(jì)算西瑞香素的質(zhì)量濃度，并計(jì)算大孔樹(shù)脂HPD600的吸附率，結(jié)果吸附率分別為97.7%，96.2%，97.0%，97.2%，97.0%；按解吸最佳條件即：90%乙醇為洗脫劑，洗脫體積為30 mL，洗脫流速為1.5 mL·min-1進(jìn)行洗脫，以“2.7.2”項(xiàng)測(cè)得西瑞香素的峰面積代入回歸方程式計(jì)算出西瑞香素的質(zhì)量濃度，并計(jì)算大孔樹(shù)脂HPD600的解吸率，結(jié)果解吸率為98.0%，91.7%，98.1%，97.3%，97.3%，富集西瑞香素回收率為95.7%，88.2%，95.1%，94.5%，94.3%。純化后西瑞香素純度由29%提高到53%。

4 討論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，大孔樹(shù)脂HPD600對(duì)了哥王中西瑞香素具有良好的吸附和解吸性能，了哥王樣品原液中的西瑞香素大部分被樹(shù)脂吸附，而且解吸的效果也很好。說(shuō)明大孔吸附樹(shù)脂HPD600是分離純化了哥王中西瑞香素的優(yōu)良材料。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HPD600純化了哥王中西瑞香素較佳吸附條件為上樣濃度約為90 μg ·mL-1，上樣液體體積為45 mL，上樣速度為1.5 mL·min-1，吸附率達(dá)97.5%；較佳的洗脫條件為乙醇濃度90%，洗脫劑體積為30 mL，洗脫速度1.5 mL·min-1，解吸率為96.4%，富集西瑞香素回收率93.6%，西瑞香素含量明顯升高，說(shuō)明該純化工藝效果良好。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為了哥王中西瑞香素的工業(yè)化純化提供了理論參考。